Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Exactas Departamento de Qumica

Extraccin, caracterizacin de sustancias hmicas y su empleo en procesos fotoqumicos de inters ambiental.

Pedro M. DAVID GARA

2008

Universidad Nacional de La Plata Facultad de Ciencias Exactas Departamento de Qumica

Extraccin, caracterizacin de sustancias hmicas y su empleo en procesos fotoqumicos de inters ambiental.

Pedro M. DAVID GARA
2008
El presente trabajo de tesis para optar al grado de Doctor en Ciencias Exactas ha sido desarrollado en el Instituto de Investigaciones Fisicoqumicas Tericas y Aplicadas, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, bajo la direccin del Dr. Daniel O. Mrtire y la Dra. Mnica C. Gonzalez.

A mis padres A Jani A Guille y Maxi

Deseo agradecer a todas las personas que de una forma u otra hicieron posible la realizacin de este trabajo de tesis:
A mis directores, Mnica y Daniel, quienes hicieron posible esta tesis brindndome todo su conocimiento y apoyo cientfico y su amistad.

A Jani, por su amor y comprensin, y por su constante ayuda en todo este trabajo de tesis. A mi familia y mi familia poltica por todo el apoyo que me brindaron, especialmente a mis padres. A Gaby, M. Laura, Pau, Vale y Vero por el esfuerzo y la dedicacin en la realizacin de los experimentos que realizamos en conjunto con cada una. A mis compaeros del grupo LEAR: Janina, Laura, Paula, Vernica, Mara Laura, Gabriela, Valeria, Marcela, Andrea y Manuel, por su apoyo y dedicacin, y por el empuje. A la gente del primer piso del INIFTA: Gustavo (el Chino), Sebastin, Paula B., Paula J., Larisa, Eugenia, Norma, Lucho, Daniela, Laura D., Gabriela P., Andrs, Carolina, Ezequiel, Alberto, Adela, Carlos y Mario, por los momentos compartidos. Al personal tcnico del INIFTA, que facilit el desarrollo de esta tesis.

A los Dres. Patricia Allegretti, Mercedes Schiavoni y Jorge Forlong del LADECOR (Dpto. de Qumica, U.N.L.P.) por su colaboracin en la determinacin de productos orgnicos de reaccin por CG-MS y HPLCMS. A la Dra Mara Teresa Del Panno del CINDEFI (Dpto. de Qumica, U.N.L.P.), por su colaboracin en los ensayos microbiolgicos. A la Dra Sonia Ulic del CEQUINOR (Dpto. de Qumica, U.N.L.P.), por su ayuda en la medicin los espectros de FTIR, y por prestarnos el equipo. A la Dra. Daniela Hozbor del IBBM (Dpto de Cs Biolgicas, U.N.L.P.), por el NBT para la deteccin de quinonas. Al Dr. Pedro Balatti del INFIVE (U.N.L.P.), por permitirme utilizar la ultracentrfuga. Al Prof. Claudio Borsarelli y a Ricardo Mignone del Dpto. Ciencias Qumicas, Facultad de Agronoma y Agroindustrias, U. N. de Santiago del Estero, por las muestras de cido hmico Aldrich purificado.

Al Dr. Reinaldo Giudici y su grupo de trabajo del Laboratorio de Simulacao e Controle de Processos del Departamento de Engenharia Quimica de la Escola Politecnica da Universidade de Sao Paulo (Brasil), por su colaboracin en los experimentos de degradacin de clomazone realizados all. A los Dres Peter Ogilby y Lars Poulsen, de la Aarhus Universitet (Dinamarca), por la realizacin de los ensayos de rendimiento cuntico de oxigeno singlete y la observacin microscpica de micelas de cidos hmicos. A los Dres Mara del Carmen Michelini y Nino Russo, del Dipartimento di Chimica, Universit della Calabria (Italia), por la colaboracin en los clculos tericos de la reaccin con el radical sulfato. Al Dr Andre Braun del Engler Bunte Institut, Universitt Karlsruhe Lehrstuhl Umweltmesstechnik Karlsruhe (Alemania), por los equipos utilizados en los ensayos de degradacin de ATCA con radicales inorgnicos. Al Dr. Renato Zanella del Grupo de Pesquisas em Anlises Cromatogrficas, Laboratrio de Anlises de Resduos de Pesticidas de la Universidade Federal de Santa Maria (Brasil), por el envo de su manuscrito: Study of the degradation of the herbicide clomazone in distilled and in irrigated rice field waters using HPLC-DAD and GC-MS,

aceptado para su publicacin en el Journal of the Brazilian Chemical Society A las autoridades de la Facultad de Ciencias Exactas de la UNLP y las del INIFTA, por haber accedido a la realizacin de mis actividades cientficas en sus instalaciones. A la UNLP, la Fundacin YPF y a CAPES, por la financiacin recibida durante la realizacin de este trabajo.

Indice

Captulo I
I-1 I-2 I-3 I-4 I-5 I-6

Introduccin.
1 11 14 16 17 21

Humus, materia orgnica y sustancias hmicas. Fotosensibilizacin y estados excitados. Mtodos oxidativos de degradacin de contaminantes. Fotodegradacin de las sustancias hmicas. Plaguicidas y su dinmica en el medio ambiente.

Objetivos. Mtodos y equipos utilizados.

Captulo II
II-1 II-2 II-3 II-4 II-5 II-6 II-7 II-8 II-9 II-10 II-11 II-12 II-13

Reactivos y preparacin de soluciones. Flash fotlisis convencional y lser. Fotlisis continua. Determinacin de la concentracin en estado estacionario de O2(1g) y HO. Anlisis de productos de reaccin Determinacin de carbono total. Espectros infrarrojos con transformada de Fourier. Matrices de excitacin emisin de fluorescencia. Imgenes de pseudomicelas de las sustancias hmicas Anlisis computacional. Determinacin de la constante de velocidad de desactivacin de oxgeno singulete. Determinacin del rendimiento cuntico de generacin de oxgeno singulete por sustancias hmicas. Ensayos microbiolgicos.

22 25 28 32 32 34 34 35 36 37 38 41 42

Resultados.
Captulo III Captulo IV Extraccin y caracterizacin de sustancias hmicas. Reactividad de las sustancias hmicas con radicales oxidantes. a.- Radical anin sulfato. b.- Estudio de la reaccin de SO4 con cido glico como modelo de las sustancias hmicas. c.- Radicales Cl y Cl2 Captulo V Degradacin fotoinducida de contaminantes a.- Clomazone b.- cido tricloroactico Captulo VI Fotodegradacin de sustancias hmicas. a.- Experimentos fotoqumicos. b.- Experimentos microbiologicos
44 64 64 78 89 96 96 110 124 124 129

Captulo VII

Conclusiones generales.
Referencias.

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Captulo I Introduccin

I-1.- Humus, materia orgnica y sustancias hmicas.

El suelo es un sistema complejo de muchos componentes (organismos vivos, material orgnico e inorgnico) que interactuan entre s, y sus propiedades son el resultado de dicha interaccin. La materia orgnica del suelo (MOS) es una mezcla heterognea que incluye tejidos de origen animal y vegetal, sus productos de descomposicin parcial resultantes de las transformaciones microbiolgicas y qumicas del proceso de humificacin, material orgnico de alto peso molecular (como por ejemplo polisacridos y protenas) y sustancias simples (como aminocidos, lpidos y monosacridos). Suele clasificarse a la materia orgnica del suelo en sustancias hmicas (SH) y sustancias no-hmicas. Estas ltimas incluyen todas la sustancias clasificables (carbohidratos, lpidos, pptidos y aminocidos, etc.), mientras que las sustancias hmicas incluyen el resto del material orgnico. La distribucin de la materia orgnica del suelo se muestra en el siguiente esquema:

Componentes orgnicos del suelo

Organismos vivos

Materia orgnica del suelo

Sustancias hmicas
Figura 1.1: Clasificacin de los componentes orgnicos del suelo.

Sustancias no hmicas

Las SH son un conjunto de sustancias coloreadas de alto peso molecular formadas por procesos bioqumicos a partir de residuos de origen animal o vegetal, bastante resistentes a la degradacin microbiolgica o qumica (por lo que tambin se denominan materia orgnica refractaria). El trmino SH suele utilizarse como nombre genrico para describir al material coloreado del suelo o a las fracciones que se obtienen en base a sus caractersticas de solubilidad: cidos hmicos (AH), cidos flvicos (AF) y huminas. Las SH estn compuestas por aproximadamente 50 % de C, entre un 35-45% de O, 5% de H, 3% de N y S [Thurman, 1985; MacCarthy, 2001]. Los principales grupos funcionales presentes incluyen grupos cidos carboxlicos y OH fenlicos.

Se han empleado numerosos mtodos para la caracterizacin de las SH. El principal problema en la caracterizacin de su funcionalidad es que la macromolcula debe fraccionarse en unidades ms pequeas. Estas tcnicas son generalmente dificultosas y consumen mucho tiempo de anlisis, y adems alteran la estructura y algunas funciones de las SH, como por ejemplo la adsorcin de contaminantes. Por ello, se han utilizado tcnicas espectroscpicas para el estudio de su estructura y funcionalidad, las que son ms simples y no destructivas [Chin y col., 1994; Hautala y col., 2000; Chen y col., 2002]. La MOS y la materia orgnica disuelta (MOD) se encuentran en equilibrio dinmico. La MOD presente en las aguas naturales vara segn la ubicacin, la geoqumica del lugar, la poca del ao, el tipo de agua, etc. El contenido de carbono orgnico disuelto (COD) en aguas subterrneas y marinas es del mismo orden, siendo los valores medios de 0.7 y 1 mg/L, respectivamente [Thurman, 1985]. Se han observado valores de COD de hasta 15 mg/L en aguas submarinas, mientras que en aguas marinas el intervalo es ms acotado, generalmente de 0.3 - 2.0 mg/L. En aguas de lagos y ros las variaciones en el COD son mucho mayores, pero generalmente las concentraciones estn por debajo de los 10 mg/L [Thurman, 1985]. En los ambientes acuticos, la masa de COD es mayor que la masa de organismos [Thomas, 1997]. La MOD de aguas naturales de la regin boreal consiste principalmentre de SH, llegando a valores del 90 % de la MOD, mientras que el promedio global es de cerca del 50 % [Thurman, 1985; Kronberg, 1999]. Uno de los inconvenientes en el estudio de estas sustancias es la falta de definiciones precisas en algunos trminos, y su utilizacin como sinnimos. Por ejemplo, se ha empleado el trmino humus para designar a la MOS, es decir a todo el material orgnico presente en el suelo incluyendo las SH. Sin embargo, en la actualidad es utilizado para representar slamente a las SH.

Propiedades de las sustancias hmicas

Las SH son un conjunto de polmeros de alto peso molecular relacionadas entre s, y sus diferentes propiedades pueden explicarse por las variaciones en el peso molecular, el tipo y nmero de grupos funcionales (carboxilo, fenol, etc.) y el grado de condensacin. En la Figura 1.2 se muestran las relaciones que existen entre las tres fracciones que la componen. En ella puede verse que el contenido de C y O, la acidez y el grado de condensacin cambian sistemticamente con el peso molecular.

Sustancias hmicas
(polmeros pigmentados)

cidos flvicos
Amarillo claro Amarillo marrn

cidos hmicos
Marrn oscuro Gris - negro

Huminas
Negro

2000 45% 48 % 1400

Aumento de la intensidad del color Aumento en el grado de condensacin Aumento en el peso molecular Aumento en el contenido de C Disminucin en el contenido de O Disminucin en la acidez intercambiable Disminucin en el grado de solubilidad

300000 65 % 30 % 500

Propiedades qumicas de las sustancias hmicas (Stevenson, 1994)

Figura 1.2: Propiedades fisicoqumicas de las SH. Acidos Hmicos: fraccin de las SH que no es soluble en soluciones acuosas cidas (pH < 2) pero s es soluble a valores mayores de pH. Puede extrarselas del suelo con diferentes reactivos. Son la mayor fraccin extrable de las SH del suelo. Presentan una coloracin entre marrn oscuro y negro. Acidos Flvicos: fraccin de las SH que es soluble en soluciones acuosas a cualquier valor de pH. Se las separa de los AH por acidificacin, y los AF permanecen en solucin. Son de color amarillo-amarronado. Huminas: fraccin de SH insoluble en agua a cualquier valor de pH. Son de color negro. Los AF son de menor peso molecular, contienen mayor proporcin de O y menor proporcin de C que los AH [Thurman, 1985; Karanfil y col., 1996]. Los AF contienen adems ms grupos funcionales cidos, principalmente grupos carboxlico (COOH). La acidez total de los AF (900 - 1400 meq/100g) es considerablemente mayor que la de los AH (400 - 870 meq/100g). Otra diferencia importante es que el oxgeno en los AF se encuentra asociado principalmente a grupos funcionales conocidos (COOH, OH, C=O), mientras que en los AH est en una alta proporcin como componente estructural. Los AF son ms abundantes que los AH en aguas naturales. Por ejemplo en Amrica del Norte las proporciones de AF y AH respecto al total del COD son 54 - 68% y 13 - 29%, respectivamente [Ma y col., 2001].
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Observaciones de AH extraidos de diferentes suelos realizadas al microscopio electrnico [Drozd, 1978] muestran que stas poseen estructura polimrica, en forma de anillos, cadenas, y clusters. El proceso de humificacin es el principal responsable de la estructura espacial de las SH en la nanoescala y de su tamao, que se encuentra en el intervalo de 60 a 500 . Como ya fue mencionado, las SH consisten de una mezcla heterognea de compuestos que no pueden englobarse en una frmula estructural sencilla. Se postul para los AH una estructura macromolecular aromtica compleja con aminocidos, azcares, pptidos y compuestos alifticos que participan en la unin entre grupos aromticos. La estructura, que se muestra en la Figura 1.3, contiene grupos OH fenlicos, estructuras quinnicas, N y O como puentes y grupos COOH aromticos.

(azucar)

(pptido)

Estructura modelo del cido hmico (Stevenson, 1982)

Figura 1.3: Estructura modelo del AH. La estructura modelo del AF (modelo de Buffle) contiene estructuras aromticas y alifticas, ambas muy sustituidas con grupos funcionales oxigenados, como se ve en la Figura 1.4.

Estructura modelo del cido flvico (Buffle, 1977)

Figura 1.4: Estructura modelo del AF. La composicin elemental de las diferentes fracciones de las SH se muestran en la Tabla 1.1 [Kononova, 1966].
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Tabla 1.1: Composicin elemental de las SH. Sustancias C Acidos Hmicos Acidos Flvicos Huminas 52 - 62 44 - 49 54 - 65 % (en base a material seco y sin cenizas) H 3,0 - 5,5 3,5 - 5,0 3.2 - 7.6 O 30 - 35 44 - 49 28 - 32 N 3,5 - 5,0 2,0 - 4,0 2.0 - 4.2

Estructura macromolecular de las SH.

A pesar de la heterogeneidad de las SH, se han encontrado muchas similitudes entre muestras de distintos orgenes. Por ejemplo, la composicin elemental de los AH y AF de varios orgenes son similares, a pesar de que las funcionalidades puedan variar mucho entre ellas [MacCarthy, 2001]. La estructura macromolecular secundaria de las SH es muy importante en la sorcin y asociacin con compuestos orgnicos. Se postul que la estructura secundaria de las SH contiene dominios pseudomiscelares del tipo de jaulas, de naturaleza hidrofbica con alto contenido de grupos aromticos [Wershaw, 1986; Engebretson y von Wandruszka, 1994]. Las pseudomicelas se consideran similares a las micelas verdaderas, pero ms grandes y sueltas, con un ncleo hidrofbico y estructuras hidroflicas en la superficie. Adems, se supone que las pseudomicelas son las responsables de la asociacin con los productos qumicos orgnicos hidrofbicos. La estructura secundaria de las SH se ha demostrado que vara con las condiciones fisicoqumicas del agua en que se encuentran [Ghosh y Schnitzer, 1980; Aho y Lehto, 1984; Tsutsuki y Kuwatsuka, 1984; Engebretson y von Wandruszka, 1994; Ephraim y col., 1995]. En condiciones de baja fuerza inica, alto pH y baja concentracin de MOD, las SH son molculas extendidas, lineales, flexibles y de alto peso molecular. Mientras que en condiciones de alta fuerza inica, bajo pH y alta concentracin de MOD, las SH son esferas globulares compactas. Adems, con el aumento de fuerza inica, el radio de los coloides disminuye [Warwick y col., 2001]. Las variaciones de tamao y forma de las SH causadas por los cambios en las propiedades fisicoqumicas de la solucin tambin se han visualizado espectromicroscpicamente [Myneni y col., 1999]. En condiciones alcalinas, los grupos funcionales principales (-COOH, -OH) se encuentran disociados y la repulsin entre las cargas negativas dificulta la formacin de los dominios hidrofbicos [Engebretson y col., 1996]. Cuando la solucin se cidifica, se neutralizan las cargas negativas, se forman los dominios hidrofbicos. Por lo tanto, la adsorcin de productos qumicos orgnicos a las SH es mayor a bajo pH [Kukkonen, 1991b; Schlautman y Morgan, 1993].
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Estudios previos tambin han demostrado que los efectos de la fuerza inica dependen de los iones usados para ajustarla y de las propiedades de la MOD. Un aumento en la concentracin de NaCl aumenta la asociacin con sustancias orgnicas, probablemente debido al efecto de la salinidad de la solucin [Gauthier y col., 1986; Jota y Hassett, 1991]. Sin embargo, Schlautman y Morgan [Schlautman y Morgan, 1993] demostraron que la adsorcin de hidrocarburos aromticos policclicos a SH disminua con el aumento de la concentracin de NaCl, en ensayos a pH fijos entre 4 y 10. Otros estudios tambin han demostrado la disminuicin de la asociacin por el incremento de la fuerza inica [Gauthier y col., 1986; Murphy y col., 1994; Jones y Tiller, 1999]. Esta disminucin se relaciona con los cambios estructurales que ocurren con el aumento de fuerza inica, tales como la formacin de esferas compactas de SH con el aumento de la concentracin de iones en la solucin. La formacin de esferas compactas obstaculiza el acceso de compuestos orgnicos a los dominios hidrofbicos e incluso impide la formacin de estos dominios. La adicin de iones metalicos como Ca2+ o Mg2+ a la solucin, disminuye las fuerzas repulsivas entre los grupos funcionales disociados, expandiendo los dominios hidrofbicos y aumentando de la adsorcin de compuestos orgnicos [Schlautman y Morgan, 1993; Engebretson y col., 1996]. Sin embargo, bajo condiciones cidas (pH < 4) el efecto de los iones metlicos es despreciable, puesto que los grupos se encuentran sin disociar. El aumento de la temperatura genera un enrollamiento intramolecular de las SH, que resulta en estructuras pseudomicelares ms rgidas [Engebretson y von Wandruszka, 1994]. Se ha demostrado que para la mayora de los compuestos orgnicos las constantes de asociacin a las SH aumentan al disminur la temperatura [ten Hulscher y Cornelissen, 1996; Lers y ten Hulscher, 1996], sin embargo su efecto no es muy marcado [Jota y Hassett, 1991]. Los compuestos orgnicos pueden interaccionar con las SH de varias maneras, incluyendo intercambio inico, puentes de hidrgeno, transferencia de carga, unin covalente o la adsorcin hidrofbica y el reparto, dependiendo del tipo de producto qumico [Senesi y Chen, 1989; Piccolo, 1994].

Formacin de las sustancias hmicas.

Se postularon diferentes teoras para la formacin de las SH durante la descomposicin de restos de origen animal o vegetal. La teora clsica postulada por Waksman, sostiene que las SH provienen de la modificacin de ligninas. En la actualidad la mayora de los investigadores apoya los mecanismos que involucran a las quinonas. En la naturaleza deben considerarse los cuatro mecanismos, incluyendo la va de condensacin de azcares y aminas, como igualmente probables para la sntesis de cidos hmicos y flvicos. Las cuatro vas pueden ocurrir en cualquier tipo de suelo, pero segn las condiciones ambientales prevalecer alguna de ellas sobre el resto. En suelos

poco drenados y en sedimentos hmedos predomina la va de las ligninas, mientras que en suelos forestados es ms importante la va de los polifenoles. Teora de la lignina: por muchos aos se pens que las SH se originaban a partir de la descomposicin de la lignina. De acuerdo a esta teora, la lignina es utilizada en forma incompleta por los microorganismos del suelo, y el residuo pasa a formar parte del humus. Entre las modificaciones sufridas en la lignina se incluyen la prdida de grupos metoxi (OCH3) para generar OH fenlicos, y la oxidacin de cadenas alifticas para formar grupos carboxilo (COOH). Este material modificado sufre posteriormente otros cambios para generar primero AH y luego AF. Waksman describe esta teora, la que se resume en la Figura 1.5, y cita como evidencia para corroborarla que tanto las ligninas como los AH son difcilmente degradados por la mayora de las bacterias y los hongos, que ambos son parcialmente solubles en alcohol y piridina, precipitan en medio cido y son solubles en medio alcalino, que ambos presentan grupos metoxi, que ambos son cidos en medios naturales, que cuando se calientan ligninas en medio alcalino se transforman en AH metoxilados, y que los AH poseen propiedades similares a las ligninas oxidadas.
Ligninas

Bloques estructurales de las ligninas

Ataque por micro organismos

Restos - Prdida de CH3 - Oxidacin - Condensacin con compuestros nitrogenados

Posterior utilizacin por microorganismos

Acidos hmicos
Fragmentacin

Acidos flvicos
Teora de la lignina (Waksman, 1932)

Figura 1.5: Teora de la lignina. Teora del polifenol: Esta teora incluye dos mecanismos cuya diferencia es el origen de los polifenoles. En uno de los mecanismos, los aldehdos y cidos fenlicos, que se generan

durante la degradacin de ligninas por los microorganismos del suelo, producen quinonas por reacciones enzimticas, las que se polimerizan para formar macromolculas del tipo de las SH. El otro mecanismo es similar, excepto que los compuestos polifenlicos son sintetizados por microorganismos a partir de sustratos distintos de la lignina (por ejemplo celulosa). Los polifenoles son luego oxidados enzimticamente a quinonas y posteriormente convertidas en SH. De acuerdo a estos conceptos, las quinonas provenientes de la lignina y las sintetizados por los microorganismos son los bloques principales a partir de los cuales se forman las SH. La formacin de compuestos de color oscuro a partir de reacciones en las que participan quinonas ya fue observado en la formacin de melanina. El rol de los microorganismos en la formacin de polifenoles fue enfatizado por Kononova, quien propone que las SH son formadas por mixobacterias que degradan celulosa antes que por descomposicin de ligninas. Las etapas que postula Kononova (Figura 1.6) para la formacin de las SH son: Primero la degradacin total por los hongos del suelo de carbohidratos simples, y parcial de protenas y celulosa de la mdula radicular y el cortex de restos de plantas. Luego la celulosa del xilema es degradada por mixobacterias aerbicas. Los polifenoles sintetizados por estas bacterias son oxidados posteriormente a quinonas por la enzima polifenoloxidasa, y por ltimo las quinonas reaccionan con compuestos nitrogenados para formar SH.
Ligninas Ataque por microorganismos Aldehdos y cidos fenolicos

Celulosa y otras sostancias no ligninas

Utilizacin por microorganismos

Posterior utilizacin por microorganismos y oxidacin a CO2

Polifenoles Polifenooxidasa Quinonas Compuestos nitrogenados

Acidos hmicos
Teora de los polifenoles (Stevenson, 1982)

Acidos flvicos

Figura 1.6: Teora de los polifenoles.

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Condensacin de azcares y aminas: de acuerdo a esta teora, los azcares y aminocidos generados en el metabolismo microbiano, son condensados por una va no enzimtica para generar polmeros pardos del tipo de los formados durante la deshidratacin de ciertos productos alimenticios a temperaturas moderadas. La principal objecin a esta teora es que a temperatura ambiente las reacciones de condensacin son muy lentas. Sin embargo, los cambios climticos y la presencia de ciertos minerales pueden catalizarlas. La reaccin de condensacin inicial entre grupos aldehdo de los azcares y las aminas genera glicosilaminas N-sustituidas, las que posteriormente reaccionan para dar 1-amino-desoxi-2cetosa N-sustituidas, aldehidos y cetonas de 3 carbonos (acetol, diacetilo, etc.), hydroximetil furfurales y enedioles o reductonas. Todos estos compuestos son muy reactivos y polimerizan rpidamente en presencia de aminas para generar productos pardos.

Funcciones de la materia organica.

La materia orgnica contribuye al desarrollo de las plantas por sus efectos en las propiedades fisicoqumicas y biolgicas del suelo. Tiene funciones: Nutricionales: Es una fuente de N, P y S para el desarrollo de las planta, a travs de su mineralizacin por los microorganismos del suelo. Adems afecta el suministro de nutrientes de otras fuentes (por ejemplo, la MOS es una fuente de energa para las bacterias fijadoras de N). Biolgicas: La MOS es una fuente de C y energa para los microorganismos y animales. El nmero de bacterias, hongos y actinomicetes est fuertemente relacionado con el contenido de humus del suelo. Por otro lado, las cantidades de lombrices y otros animales estn relacionadas con la cantidad de restos vegetales presentes en el suelo. Algunas sustancias orgnicas del suelo tienen efectos fisiolgicos directos en el crecimiento vegetal. Por ejemplo, algunos polifenoles poseen propiedades fitotxicas. Mientras que otros compuestos, como las auxinas promueven el desarrollo de plantas. Algunos compuestos biolgicamente activos, como los antibiticos y ciertos cidos polifenlicos, promueven la habilidad de algunas plantas de resistir el ataque de microorganismos fitopatgenos. Por otro lado, su incidencia est influenciada por la MOS, prevaleciendo el desarrollo de los microorganismos saprfitos respecto de los patgenos en suelos con alto contenido de MO. Fsicas y fsico-qumicas: Promueve la estructura del suelo, mejorando su aireacin, la retencin de agua y su capacidad buffer y de intercambio de iones. La adicin de residuos orgnicos fcilmente degradables permite la sntesis de compuestos orgnicos complejos a los que se unen partculas del suelo formando agregados, los que ayudan a mantener la porosidad y la granulosidad del suelo. Esto facilita la percolacin del agua y el suministro continuo de oxgeno
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necesario para el desarrollo de las plantas. Adems, las SH aumentan la resistencia del suelo a la erosin. Del total de la capacidad de intercambio catinico, entre el 20 y el 70 % corresponde a las SH coloidales. La MOD, y especialmente las SH, contribuyen significativamente a la acidez de las aguas naturales. Los cidos orgnicos de la MOD son los principales responsables del bajo pH de los lagos finlandeses, mientras que en Norteamrica la causa es la lluvia cida y las actividades antropognicas [Kortelainen, 1999]. La acidez total de las fracciones de humus aisladas de suelo se encuentra en el intervalo de 300 a 1400 meq/100 g. Las SH exiben una amplia capacidad buffer, en un amplio intervalo de pH. Rol Ecologico. La MOD atenua la luz visible y ultravioleta (UV) en aguas naturales [Jones y Arvola, 1984; Huovinen y col., 2000]. La absorcin de la luz por SH aumenta a medida que disminuye la longitud de onda [Scully y Lean, 1994], y es ms importante en la regin UV de alta energa donde sus efectos son ms peligrosos. La atenuacin de la luz disminuye el desarrollo de organismos auttrofos. Adems, durante los procesos fotoqumicos de degradacin de la MOD se generan especies reactivas dainas [Frimmel, 1994]. La degradacin fotoqumica de la MOD consume oxgeno, y por lo tanto la luz solar disminuye la oxigenacin de las aguas naturales con alto contenido de MOD [Lindell y Rai, 1994]. Sin embargo, la mayor parte de la energa de la luz solar es transformada en calor [Mnster y col., 1999]. Como la luz puede penetrar slo las capas superficiales de los lagos de aguas con alto contenido de MOD, se calienta la capa superficial y se genera una estratificacin trmica del agua. Esto disminuye el transporte de oxgeno hacia las capas ms profundas, generando una deficiencia de oxgeno cerca del fondo [Eloranta, 1999]. Las bacterias pueden utilizar algunas fracciones de la MOD como fuente de energa [Thomas, 1997], las que se denominan en general materia orgnica (o carbono orgnico) asimilable. Mientras que el color de las aguas superficiales est relacionado con las fracciones de la MOD de mayor peso molecular (>10000 Daltons), la materia orgnica asimilable se relaciona con la de menor tamao (<1000 Daltons) [Hem y Efraimsen, 2001]. La MOD no es fcilmente removible del agua, y durante el proceso de desinfeccin y potabilizacin del agua se generan compuestos txicos clorados [Kronberg y Christman, 1989; Matsuda y col., 1992]. Adems, durante esta desinfeccin, la MOD se rompe en unidades ms pequeas, las que son mejores fuentes de energa para los microorganismos [Miettinen y col., 1996]. Sin embargo, en las regiones boreales donde el contenido de MOD del agua potable es mayor, el desarrollo de los microorganismos est limitado por la baja concentracin de nutrientes inorgnicos [Miettinen y col., 1996]. La asociacin con la MOD afecta la distribucin medioambiental de distintos contaminantes. Distintos procesos como el transporte, la solubilidad, la degradacin, la

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volatilizacin y la biodisponibilidad de compuestos orgnicos hidrofbicos, estn controlados por la presencia de MOD [Piccolo, 1994].

I-2.- Fotosensibilizacin y estados excitados. Importancia de estos procesos en aguas naturales.

El estado energtico fundamental de cualquier molcula corresponde a su configuracin o distribucin electrnica de menor energa. Los estados electrnicamente excitados de las molculas se forman cuando stas absorben energa, normalmente en forma de luz. En ellos, las molculas tienen configuraciones electrnicas diferentes y ms energticas que la del estado fundamental. [Turro, 1991; Braun y col., 1991]. Los estados excitados presentan configuraciones electrnicas que tienen una duracin limitada, por lo que tienden a regresar al estado fundamental pasado un corto lapso de tiempo. Este periodo puede tener una duracin comprendida entre los milisegundos (103 s) y los picosegundos (1012 s), y est caracterizado por el tiempo de vida (), que es el tiempo requerido para que el nmero de molculas excitadas caiga a una fraccin (1/e) de su valor original. El tiempo de vida es caracterstico de cada estado excitado y del medio que circunda a las molculas. Una molcula presenta un estado energtico de carcter singlete cuando sus dos electrones ms externos se encuentran apareados, es decir, cuando tienen nmeros cunticos de espn opuestos o antiparalelos. Por otro lado, una molcula presenta un estado energtico de carcter triplete cuando sus dos electrones ms externos se encuentran desapareados o paralelos, esto es, cuando tienen nmeros cunticos de espn iguales. Tpicamente, el estado fundamental de la mayora de las molculas orgnicas suele tener carcter singlete (S0), mientras que los estados excitados de cualquier molcula pueden tener carcter singlete (S1) o triplete (T1). Un estado excitado singlete es de mayor energa que su correspondiente estado excitado triplete debido a la energa de apareamiento electrnico necesaria para que los dos electrones ms externos tengan espines antiparalelos. Normalmente, toda molcula que absorbe un fotn de luz de longitud de onda adecuada puede alcanzar alguno de sus estados excitados. Sin embargo, las reglas de la mecnica cuntica establecen que, en ciertos casos, la probabilidad de absorcin de un fotn para producir la excitacin es muy baja, incluso nula. En estos casos, para poblar el estado excitado es necesario acudir al proceso de transferencia de energa. La fotosensibilizacin supone la generacin, mediante absorcin de luz, del estado excitado de una molcula, llamada fotosensibilizador, de manera que ste, durante el tiempo de vida de su estado excitado, es capaz de ceder o transferir su exceso de energa a otra molcula
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presente en el medio circundante, obtenindose un estado excitado de la misma. La nueva molcula excitada, durante su tiempo de vida, puede reaccionar con otras especies qumicas existentes en el medio, dando lugar a productos de reaccin o, en caso de que no lo haga, terminar regresando a su correspondiente estado fundamental tras la liberacin de su exceso de energa al medio circundante. El uso de la fotosensibilizacin para la produccin de especies reactivas mediante energa solar permite el desarrollo de nuevas tecnologas fotoqumicas limpias y basadas en energas renovables, aplicables a la desinfeccin de aguas. Los procesos fotoqumicos que ocurren en aguas superficiales inducidos por la luz solar afectan la qumica redox de estas aguas [Zerp, 1980], y la de los contaminantes que se encuentran disueltos en ellas. Las SH constituyen casi la mitad del COD en aguas naturales y son las sustancias que ms absorben la luz solar en las aguas naturales. A partir del proceso de absorcin de luz UV-visible se generan tripletes de las SH [Zerp y col, 1981; Zerp y col, 1985], los que interaccionan con especies presentes en el agua formando intermediarios reactivos como por ejemplo: Oxgeno singulete (O2(1g)) [Zerp y col, 1981;Wolff y col., 1981] Radicales alquilperoxido (RO2) [Mill y col., 1980: Drapper y Crosby, 1984] Radicales hidroxilo (OH) [Mill y col., 1980; Drapper y Crosby, 1984; Haag y Hoigne, 1985] Radicales anion superoxido (O2[ )Cooper y Zika, 1983; Drapper y Crosby, 1983] En aguas naturales, en presencia de iones Fe(III), Cl, Br y HCO3, se forman tambin otras especies reactivas como por ejemplo los radicales HCO3, Cl2, y Br2. Adems, datos experimentales indican que las SH fotoionizan y liberan los electrones que posteriormente se hidratan [Fisher y col, 1985; Zerp y col, 1987; Zaifiriou y col, 1984]. Los procesos que generan estas especies reactivas se esquematizan en las Figuras 1.7 y 1.8. Estos intermediarios reactivos son los responsables de la oxidacin de contaminantes orgnicos y de la MOD.

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SH* (estados excitados) e (ac) , O2 HO , O , O3 O2(1g) RO2 , H2O2

h
Materia Orgnica Disuelta SUSTANCIAS HMICAS

Especies Reactivas

Figura 1.7: Esquema del proceso de fotosensibilizacin en aguas naturales. Las SH pueden absorber luz solar y generar fotorreacciones indirectas con compuestos orgnicos que no absorben la radiacin solar. La concentracin de los tripletes de las SH en estado estacionario a una profundidad de 1 cm sobre la superficie del agua es del orden de 10-14 M. Si el nivel de energa de los tripletes de las SH es de alrededor de 57 kcal/mol, entonces especies contaminantes con tripletes de menores niveles de energa pueden reaccionar por un mecanismo de transferencia de energa mediado por las SH o la MOD. Adems, si el potencial de reduccin de un intermediario reactivo producido por las SH es ms alto que el de un xenobitico, ste puede oxidarse, si la reaccin redox es cinticamente favorable [Fisher y col, 1987].

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2 Br-/ Clh h SH* (FeIII) SH + OH HCO3O2

3

Br2 - / Cl2 + OH

CO3 - + H2O

SH

SH*

SH + 1O2

P e-aq + SH.+ O2 O2 -

RO2 O2 O2 2 H+ O2 + H2O2

SH + P O2

. +

Figura 1.8: Principales reacciones que tienen lugar en aguas naturales para la generacin de especies reactivas por fotosensibilizacin con SH [Cooper y col., 1989; Hoigne y col., 1989; Haag y Mill, 1990; Aguer y col., 1999; Richard y Canonica, 2005].

I-3.- Mtodos oxidativos de degradacin de contaminantes.

La creciente preocupacin por los temas relacionados con el medioambiente y la contaminacin, han impulsado la bsqueda de mtodos ms eficientes para la eliminacin de las sustancias contaminantes generadas principalmente en la actividad industrial. Entre ellos, la utilizacin de la radiacin solar como fuente para el desarrollo de procesos qumicos para oxidar compuestos es una de las ms estudiadas. La detoxificacin solar se basa en utilizar la luz del sol, o de fuentes luminosas con caractersticas de emisin semejantes, para eliminar compuestos orgnicos que estn presentes en efluentes lquidos o en suelos contaminados. Los mtodos se dividen entre los que utilizan la radiacin solar como fuente de calor para la oxidacin trmica de los contaminantes, y aqullos que utilizan la luz UV-visible para la oxidacin fotoqumica de los mismos. Los primeros requieren dispositivos de alta concentracin solar para alcanzar las elevadas temperaturas necesarias, mientras que los segundos no requieren concentracin por lo que son ms fcilmente aplicables. Los mtodos fotoqumicos comprenden los procesos de oxidacin avanzada, donde se generan especies fuertemente oxidantes capaces de oxidar compuestos orgnicos no biodegradables y convertirlos en compuestos inorgnicos e inocuos. Como fuente de luz puede
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usarse la radiacin solar, lmparas de mercurio o xenn de arco de alta presin, en el rango UVcercano ( entre 300-370 nm), y lmparas germicidas en el UV-lejano (180-290 nm). El uso de luz solar asegura un considerable ahorro energtico, permitiendo a su vez el desarrollo de instalaciones industriales ms seguras. Estos procesos se caracterizan por su versatilidad, al poder utilizarse con mezclas complejas de contaminantes, lo que hace que puedan ser empleados para el procesamiento de aguas residuales resistentes a los tratamientos convencionales. Entre los mtodos de detoxificacin fotoqumica pueden mencionarse la fotocatlisis homognea o heterognea, la fotlisis directa, la fotosensibilizacin, la fotlisis del agua en ultravioleta de vaco (UVV) y la radilisis. La oxidacin qumica "in-situ" (ISCO, de su sigla en ingls In Situ Chemical Oxidation) implica la introduccin de un oxidante qumico en la zona afectada con el fin de transformar los contaminantes del agua o del suelo en especies qumicas menos dainas. Entre los oxidantes ms utilizados se encuentran el permanganato de potasio, el peroxido de hidrgeno y el sistema tipo Fenton, el ozono y el peroxodisulfato de sodio. Las tecnologas ISCO basadas en el uso de permanganato se encuentran ms desarrolladas que el resto. La oxidacin "in-situ" con Fenton es compleja y el desarrollo de la tecnologa ha sido ms lento. El ozono es un oxidante fuerte pero su uso es mucho ms limitado que los anteriores. El tratamiento con S2O82- es una tecnologa relativamente nueva, la cual se ha investigado principalmente en escala piloto. Todos los oxidantes mostrados en la Tabla 1.2 tienen suficiente poder oxidante como para degradar a la mayora de los contaminantes orgnicos. El potencial de la oxidacin de cada especie reactiva es una medida de la capacidad degradativa, pero no de la velocidad con que reaccionan con los distintos compuestos orgnicos ni de su eficiencia bajo condiciones del campo. Los potenciales de oxidacin de las reacciones son dependientes de muchas variables que deben considerarse simultneamente, incluyendo temperatura, pH, concentracin de reactivos, catalizadores, subproductos de la reaccin, y otros componentes del sistema (por ejemplo materia orgnica, desactivadores del oxidante, etc.) El tratamiento qumico oxidativo es aplicable a una amplia gama de contaminantes. Las mezclas de contaminantes pueden requerir tratamientos que implican el uso secuencial de tecnologas para lograr el objetivo del tratamiento. La presencia de MOD puede disminuir la eficacia de los mtos oxidativos de decontaminacin o de desinfeccin de aguas naturales, y puede conducir a la formacin de productos inorgnicos y orgnicos txicos durante el proceso de desinfeccin del agua potable (por ejemplo organo-halogenados, aldehidos) [Glaze y col., 1993; Renken, 1994; Owen y col., 1995].

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Tabla 1.2: Principales especies reactivas generadas en los tratamientos ISCO y sus potenciales de oxidacin. Oxidante Peroxido de hidrgeno y Fenton H2O2 + 2 H + 2 e 2 H2O (peroxido de hidrgeno) 2 OH + 2 H+ + 2 e 2 H2O (radical hidroxilo) HO2 + 2 H+ + 2 e 2 H2O (radical perhidroxilo) O2 + 4 H+ + 3 e 2 H2O (radical superoxido) HO2 + H2O + 2 e 3 OH-(hydroperoxide anion) Ozono + O3 + 2 H + 2 e O2 + H2O (ozono) 2 O3 + 3 H2O2 4 O2 + 2 OH + 2 H2O (radical hidroxilo) Peroxodisulfato 2 S2O8 + 2 e 2 SO42( peroxodisulfato) SO4 + e SO42( radical sulfato)
+

Potencial de electrodo 1.8 V 2.8 V 1.7 V - 2.4 V -0.88 V 2.1 V 2.8 V 2.1 V 2.6 V

En particular, la destruccin de compuestos orgnicos por oxidaciones activadas por peroxodisulfato, directamente o a travs del radical anin sulfato, de aguas y de suelos est ganando inters como tecnologa de decontaminacin qumica oxidativa [Liang y col., 2004; Gates y Siegrist, 1995; Amarante, 2000; MacKinnon y Thomson, 2002]. La oxidacin con peroxodisulfato se realiza generalmente activada por calor, luz, cidos, bases o iones metlicos, ya que las velocidades del proceso oxidativo son mucho mayores por la participacin de especies radicalarias [House, 1962; Anipsitakis y Dionysiou, 2003]. El costo de la destruccin del material orgnico con tecnologas ISCO se relaciona directamente con el contenido del carbono, con la matriz de la zona tratada, y con la posibilidad de reciclaje. Los costos son ms altos para residuos muy clorados o con alto contenido de sustancias orgnicas no txicas, tales como las SH en suelos y aguas contaminadas, por la desactivacin de los radicales sulfato por los iones cloruro o la MO.

I-4.- Fotodegradacin de las sustancias hmicas.

Luego de la irradiacin de diversas aguas naturales con luz solar, se ha detectado la produccin de sustancias de bajo peso molecular con grupos carbonlo (formaldehdo, acetaldehido, acetona, glioxal, glioxalato, piruvato), y cidos carboxlicos (cido frmico, actico, propanoico, glicolico, oxlico, malnico y succnico), los que representan el 10 % del COD [Kulovaara, 1995], as como tambin pequeas cantidades de cidos grasos de 16 y 18 tomos de carbono. Diversos autores sugirieron que la degradacin fotoqumica de las SH es una de las fuentes principales de compuestos de bajo peso molecular biolgicamente activos en las aguas naturales [Kova y col., 2006]. Luego de ms de 120 horas de exposicin a la luz solar se observ
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que la absorbancia a 254 nm y la cantidad de COD en las muestras irradiadas alcanzan un estado estacionario antes del final del perodo de la irradiacin, con valores de 5 % y 40 % de los iniciales [Kulovaara, 1995]. Se observ adems que el pH se mantena estable durante toda la irradiacin, y que luego de 72 horas las muestras perdan su coloracin. Tambin se detectaron los siguientes cambios en la distribucin del peso molecular: luego de 24 hs de irradiacin aumenta la concentracin de los compuestos de bajo peso molecular, despus de 72 hs aparece un pico cromatogrfico de alto peso molecular, el cual desaparece luego de 120 hs, al mismo tiempo aparece un precipitado marrn. La fotodegradacin tambin conduce a la mineralizacin parcial de la MOD a CO2. Las SH de bajo peso molecular son ms sensibles a la fotodegradacin que las de alto peso molecular. La degradacin de SH con la luz UV es similar que con luz solar, pero sta es ms eficiente en aire que en atmsfera del N2. Despus de 1 hora de exposicin, se observa una disminucin del 25 % de la absorbancia a 254 nm, mientras que el contenido del COD se mantiene constante. Cuando se adiciona perxido de hidrgeno, la absorbancia disminuye un 96 % y el contenido del COD se reduce al 77 %, y el pH vara a tiempos cortos y luego alcanza un estado estacionario [Backlund, 1992]. El aumento en la dosis de H2O2 (de 90 a 225 mg/1) conlleva a una degradacin ms eficiente, pero un mayor aumento no tiene efectos en el contenido del COD ni en la absorbancia UV. Los cambios en la distribucin en masa son similares a los mencionados en la degradacin con luz solar, pero ocurren en forma ms rpida. Se encontr que el precipitado tiene contenido mucho ms aliftico que las SH. Los productos principales de la degradacin son: cido oxlico, actico, malnico y N-butanoico.

I-5.- Plaguicidas y su dinmica en el medio ambiente.

Se denomina plaguicida a todo producto qumico utilizado para destruir plagas o controlar su proliferacin. En la agricultura es frecuente el uso de herbicidas, insecticidas, fungicidas, nematocidas y roedenticidas. Considerando la gran variedad y cantidad de plaguicidas que utiliza la agricultura actualmente es significativo el impacto ambiental de sus residuos. Los plaguicidas son extremadamente txicos por contar con una elevada capacidad biocida. Los plaguicidas pueden ser contaminantes del suelo como resultado de su persistencia luego del uso, permeabilidad, derrames accidentales, y como residuos de la industria de los mismos. En el ambiente acutico los casos frecuentes de contaminacin por plaguicidas se dan como consecuencia del almacenamiento y distribucin inadecuados de los productos agroqumicos. La presencia de plaguicidas en los suelos y aguas naturales se produce por diferentes causas. Dependiendo del mtodo de aplicacin, entre un 30 y un 100 % del plaguicida llega
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directamente al suelo [Arnold y Briggs, 1990]. Una vez en el suelo, los plaguicidas sufren una serie de procesos fsicos, qumicos y/o biolgicos, los que se encuentran relacionados entre s y se esquematizan en la Figura 1.9. Estos procesos pueden agruparse en dos categoras: los de transferencia - transporte y los de transformacin - degradacin, como se detalla en la Tabla 1.3. Los procesos de transporte implican un movimiento del plaguicida entre las diferentes fases del suelo, mientras que en los procesos de transformacin existe un cambio en la estructura del compuesto [Cornejo y Moreno, 1998]. Tabla 1.3: Procesos que intervienen en la dinmica de los plaguicidas en suelos. Procesos Transferencia y transporte Adsorcin - desorcin Volatilizacin Difusin y arrastre Absorcin por las plantas Lixiviacin Qumica Fotoqumica Biolgica

Transformacin y degradacin

Absorcin y exudacin Adsoracin Desorcin Degradacin qumica Lixiviacin Biodegrdacin

Nivel fretico

Figura 1.9: Procesos que intervienen en la dinmica de los plaguicidas en el ambiente.

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Volatilizacin

Foto degradacin

Infiltracin

Los plaguicidas pueden adsorberse tanto a la matriz inorgnica del suelo (principalmente a la fraccin arcillosa) como a la MOS. Con esta ltima fraccin las interacciones son bsicamente del tipo hidrofbicas. Los procesos de adsorcin - desorcin tienen gran importancia, puesto que al determinar la cantidad de plaguicida presente, controlar otros procesos que afectan la dinmica de los mismos. Por ejemplo, la adsorcin del plaguicida puede producir una disminucin importante en su fotodegradacin [Sukul y Spiteller, 2001], volatilizacin [Chester y col., 1989], y biodisponibilidad [Walker y col., 1989; Pignatello y Xing, 1996], mientras que la desorcin incrementa estos procesos. Por otro lado, los procesos de adsorcin pueden catalizar procesos de degradacin qumica [Cox y col., 1994] y fotlisis [Senesi, 1993], pero tambin pueden proteger de la degradacin bitica y fotoqumica [Hermosin y col., 1982; Romero y col., 1998; Aguer y col., 2000].

Procesos de degradacin de plaguicidas

Los plaguicidas son afectados por diferentes transformaciones que llevan a su desaparicin del medio ambiente [Cheng y Lehman, 1985], y por lo tanto reducen la contaminacin. Muchos plaguicidas se disipan rpidamente en los suelos por un proceso de mineralizacin y el resultado es la conversin del plaguicida en compuestos ms simples (H2O, CO2, cidos inorgnicos y NH3). Si bien participan en este proceso reacciones qumicas, como por ejemplo hidrlisis, oxidacin y fotlisis, el responsable principal de su mineralizacin es el metabolismo microbiolgico. La microbiota del suelo utiliza a los plaguicidas como fuente de carbono y otros nutrientes. Sin embargo, el proceso de degradacin qumica, microbiana o fotoqumica puede llevar a la formacin de productos, cuya toxicidad puede ser mayor, igual o menor que la del compuesto original. El tratamiento biolgico de degradacin de contaminantes, tanto en aguas de desecho como en suelos suele ser el proceso ms econmico. Sin embargo, cuando los contaminantes son muy txicos y persistentes, los procesos biolgicos no son eficientes, tal es el caso de los plaguicidas. El efecto de la materia orgnica (MO) en el proceso de biodegradacin es antagnico. Por un lado, al adsorber al plaguicida se reduce su biodegradacin [Ainsworth y col., 1989; Barriuso y col., 1997; Guo y col., 2000] y por el otro lado, al ser la MO sustrato nutritivo para los microorganismos, aumenta la poblacin microbiana y por ende incrementa la degradacin de los plaguicidas biodegradables [Cox y col., 1999; Hole y col., 2001] La fotodegradacin consiste en la descomposicin del plaguicida como consecuencia de la energa de la luz solar. Este proceso es importante en los primeros centmetros del suelo, en la superficie de las plantas y en los ecosistemas acuticos superficiales. Puede dividirse en tres clases: fotodegradacin directa, fotosensibilizacin y fotocatlisis. La fotodegradacin directa
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resulta de la absorcin de luz UV de baja longitud de onda (principalmente UV-A y UV-B), lo que genera estados electrnicos excitados (singuletes o tripletes) de los plaguicidas. Estas especies excitadas pueden sufrir procesos de homlisis, heterlisis y fotoionizacin [Pusino y col., 1999; Samanta y col., 1999; Aguer y col., 2000; Da Silva y col., 2001]. El proceso de fotosensibilizacin ya fue explicado previamente, y su ventaja es que utiliza generalmente luz de mayores longitudes de onda [Aguer y col., 2000]. Los procedimientos modernos para la degradacin oxidativa de compuestos orgnicos disueltos y /o dispersos en aguas, son tcnica y econmicamente una alternativa atractiva para el tratamiento de este tipo de desechos. Estos procesos comprenden mtodos catalticos y/o fotoqumicos en los que se generan intermediarios reactivos capaces de iniciar la oxidacin de muchos contaminantes orgnicos, como ya fue descripto previamente.

En este trabajo se han empleado dos contaminantes modelo: el clomazone y el cido tricloroactico (ATCA). El clomazone [2-[(2-clorofenil)metil-4,4-dimetil-3-isoxazolidinona], cuya estructura se muestra en la Figura 1.10, es un herbicida que se aplica directamente en el suelo para controlar selectivamente a varias hierbas. Actua inhibiendo la sntesis de clorofila y carotenoides en las plantas sensibles al compuesto, disminuyendo la cantidad de foliaje y su pigmentacin [Mervosh y col., 1995].
Cl O N CH3 CH3 O CH2

Figura 1.10: Estructura qumica del clomazone El ATCA es altamente fitotxico, y es en parte responsable de la falta de vegetacin debajo de los rboles de conferas debido a su acumulacin en las hojas y en los suelos [McCulloch, 2001]. Su alta solubilidad en agua es una de las principales razones de su alta movilidad en suelos, y por lo tanto se lixivia fcilmente a la capa fretica [Mller y col., 1996]. Una fuente importante de ATCA en la actualidad es la actividad antropognica, ya que este contaminante proviene de los efluentes de las plantas de tratamiento oxidativo de aguas residuales [Betts, 1998]. Hay evidencia de que el ATCA se dehalogena por los microorganismos del suelo [McCulloch, 2001]. Su eliminacin de las aguas provenientes del tratamiento oxidativo de aguas
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de desecho es eficaz solamente por mtodos de fotlisis en el vaco del agua [Kruithof y col., 2002; Wrner y col., 1998; Roman y col., 1997], y no puede ser totalmente removido por la fotlisis UVC [Wrner y col., 1998]. Sin embargo, el ATCA es reducido eficientemente por el electrn hidratado [Roman y col., 1997; Hart y Anbar, 1970], por transferencia electrnica con catalizadores de Pt/TiO2 irradiados [Bae y Choi, 2003], y con electrodos de semiconductores de SiC [Schnabel, 2001]. Tambin se ha publicado la descomposicin de ATCA a alta temperatura por ruptura heteroltica de los enlaces C-C [McCulloch, 2001; Hine, 1950].

I-6.- Objetivos de este trabajo de tesis:

Extraer sustancias hmicas de vermicompost y caracterizarlas. Investigar la capacidad de generar especies reactivas por fotosensibilizacin. Estudiar la reactividad de las sustancias hmicas con radicales inorgnicos oxidantes. Investigar la degradacin de contaminantes por mtodos fotoqumicos y sensibilizados por sustancias hmicas. Plantear los mecanismos de reaccin involucrados en los dos objetivos anteriores. Estudiar el rol de las sustancias hmicas y su fotodegradacin en el desarrollo de microorganismos aislados del medio ambiente.

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Captulo II Mtodos y equipos utilizados

II-1. Reactivos utilizados y preparacin de soluciones. En este trabajo se utilizaron las siguientes drogas, tal como se recibieron y sin posterior purificacin: Na2S2O8, HClO4, NaClO4, NaOH, NaCl, metanol (CH3OH), cido frmico (HCO2H), formiato de sdio (HCO2Na), cido tricloroactico (CCl3CO2H), cido glico (C7H6O5), isopropanol (C3H8O) y fenol (C6H6O), todos de Merck. D2O, NaN3, alcohol furfurlico (C5H6O2), glicina (C2H5O2N), histidina (C6H9O2N3), Rosa de Bengala [3,4,5,7-tetracloro-2,4,5,7-tetraiodo fluoresceina disodio] (C20H9O5Cl4I4Na2) y la enzima Superxido dismutasa (SOD), todos de Sigma Aldrich. TMPyP [5,10,15,20-tetrakis (N-metil-4-piridil)-21H, 23Hporfinatetratoluensulfonato] (C72H66N8O12S4) de Aldrich. HCl y Tolueno (C7H8) de J.T.Baker. NaBH4 de Riedel-de Han. H2O2 de Riedel-de Han o Merck. Mg(ClO4)2 de Mallinckrodt Clomazone [2-(2-clorofenil) metil-4,4-dimetil-3-isoxazolidona] (C12H14O2NCl) de Clariant. Azul de nitrotetrazolio [Dicloruro de 3,3'-(3,3'-dimetoxi(1,1'-bifenil)-4,4'-diil)bis(2-(4-nitrofenil)5-fenil] (C40H30O6N10Cl2) de Gibco El agua destilada utilizada se filtr mediante un sistema Millipore (>18 M cm-1, < 20 ppb de carbono orgnico). Para la determinacin de las masas se utiliz una balanza electrnica marca A&D modelo ER-182A cuya precisin es de 0,1 mg. En todos los casos, se trabaj con soluciones recientemente preparadas de todos los reactivos. Para la completa disolucin del clomazone, la solucin preparada se mantiene en agitacin magntica durante una hora. Para solubilizar al cido hmico Aldrich purificado, la solucin se alcaliniza a pH 8 con NaOH y luego se sonica por 2 o 3 horas, con un sonicador ULTRAsonic cleaner modelo 19H. Las medidas potenciometricas de pH y iones disueltos en solucin se realizaron con electrodos selectivos y un analizador multicanal Consort C832. Las medidas de absorbancia se realizaron con un espectrofotmetro de doble haz Cary 3 UV-Visible (Varian, Australia), con ancho de banda entre 0.2 y 4.0 nm de acuerdo con el ancho de rendija seleccionado. Las celdas utilizadas son de cuarzo de 0.2 o 1.0 cm de camino ptico, dependiendo del volumen disponible. Las absorbancias de las sustancias hmicas se midieron con

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soluciones de aproximadamente 20 mg L -1 cuyo pH se ajust a 7, y las absortividades (E) a 280, 465 y 665 nm se calcularon como: E = absorbancia [HS en g L -1] x (%C/100)

Para regular la concentracin de oxgeno disuelto en la muestra se burbujearon durante 15 minutos las soluciones con oxgeno, aire sinttico, argn o nitrgeno de alta pureza. Las sustancias hmicas comerciales que se utilizaron en este trabajo son la sal sdica del cido hmico Aldrich (AHA) y los cidos hmico y flvico de turba de Waskish de la International Humic Substances Society (AH y AF IHSS). Se compararon los comportamientos de reactividad con el radical sulfato del cido hmico Aldrich (AHA) comercial y el AHA purificado. Este ltimo fue purificado en el grupo del Prof. Claudio Borsarelli, de la UNSE, segn metodologa descripta en literatura [Saito y col., 2004]. En esta purificacin se remueven las trazas de iones metlicos, el material inorgnico y el material orgnico distinto del cido hmico. En las siguientes tablas se listan algunas propiedades fisicoqumicas informadas por los proveedores de las mismas. Tabla 2.1: Composicin elemental de las sustancias hmicas comerciales. Sustancia hmica AHA AH IHSS AF IHSS Composicin elemental % C H N O S 51.5 4.8 0.9 37.5 3.3 54.7 4.0 1.5 38.5 0.4 53.6 4.2 1.1 41.8 0.3

Tabla 2.2: Distribucin funcional del carbono de las sustancias hmicas comerciales. Sustancia hmica AHA AH IHSS AF IHSS Composicin funcional de carbono (%) aliftico carbohidratos aromtico carbonlico 44.8 14.2 32.4 16.1 21.0 18.1 26.5 21.3 37.1 36.2 14.4 24.3

Los extractos de materia orgnica a partir de vermicompost de origen comercial se hicieron en el laboratorio modificando la metodologa descripta en literatura [Swift, 1996; Tinoco Pastor, 2000; Ganuza Monje, 2001]. El vermicompost posee una alta concentracin de sustancias hmicas, composicin relativamente uniforme y tamao de partcula relativamente homogneo. 40 23

g del vermicompost tamizado con malla de 0.7 mm se mezclaron con una solucin de 250 mL de NaOH a pH 9.0 y la suspensin resultante luego de mantenerla en agitacin por una hora, se filtr con papel de filtro banda blanca (5892, Schleicher & Scuell) para retener las partculas de tamao mayor a 12 m. La solucin fue evaporada en rotavapor a 40C y una presin de entre 30 y 50 torr, para obtener un slido con alto contenido en sustancias hmicas. El extracto de suelo utilizado en los ensayos microbiolgicos fue obtenido a partir de suelo del Parque Provincial Pereyra Iraola del partido de Berazategui, Prov. de Buernos Aires (34 52 S, 58 08 O). Las caractersticas de dicho suelo se listan en la Tabla 2.3. Para obtener el extracto, se mezclaron 300 g de suelo con 780 ml de agua destilada y se esteriliz en autoclave a 121 C en dos ciclos seguidos de 30 min. Luego se filtr con papel de filtro de poro menor a 0.8 m para disminuir la turbidez. Posteriormente se vuelve a esterilizar en autoclave (30 minutos a 121 C). El extracto se guard en heladera a 4 C hasta su utilizacin. Tabla 2.3: propiedades del suelo utilizado. Anlisis pH Carbono orgnico Materia orgnica Nitrgeno total Relacin C / N Fsforo asimilable Capacidad de intercambio catinico Granulometra Bray-Kurtz I Saturacin con acetato de amonio, y cuantificacin por volumetra. Bouyoucos arcilla (<2m) limo (2-50 m) arena (50-2000 m) Clase textural Walkley-Black TOC % C orgnico x factor 1.724 Kjeldahl Mtodo Valor 5,6 3.60 % 3.76 6.21 % 0.296 % 12.2 4.2 mg/kg 23.7 meq/100g 23.9 % 56.1 % 20.0 % Franco Limosa

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II-2. Mtodo de flash fotlisis El mtodo de flash fotlisis fue desarrollado por Norrish y Porter en 1948, utilizado para la iniciacin y el estudio de procesos fotoqumicos. En esta tcnica se crea una situacin de no equilibrio en la mezcla de reaccin en un intervalo de tiempo corto, generando intermediarios inestables en concentraciones relativamente altas. Flash fotlisis Convencional (FFC). Un equipo convencional de flash-fotlisis consta de tres partes principales: un arreglo experimental para producir un corto e intenso pulso de luz, un reactor o celda de reaccin y un sistema de deteccin, tal como se esquematiza en la Figura 2.1. El equipo utilizado en este trabajo es un aparato Xenon Co, modelo 720 C, cuya ptica y electrnica fueron modificadas con el objeto de aumentar la sensibilidad de deteccin [San Romn y col., 1980]. El equipo trabaja en modo cintico, es decir, registrando los cambios de absorcin en funcin del tiempo a una longitud de onda fija. Los espectros de absorcin de los transientes se obtienen tomando el valor de absorbancia del ajuste de las trazas experimentales a un tiempo determinado para cada longitud de onda de anlisis. Las trazas experimentales deben ser tomadas manteniendo las condiciones experimentales. El pulso de luz se logra mediante la descarga de un banco de capacitares (Cap) sobre las lmparas de flash (L) que en nuestro caso, consisten en 2 tubos de cuarzo llenos de xenn a presin moderada (Xenon Co. FP-5-100C) ubicados a ambos lados de la celda de reaccin. El disparo est sincronizado con el osciloscopio. Las lmparas emiten entre 210 nm y 600 nm, con un mximo alrededor de los 400 nm. La intensidad de la descarga de los capacitores del flash se encuentra entre los 0,8 y 7,2 kV. La celda de reaccin (C) es un cilindro de cuarzo con una camisa concntrica del mismo material que puede ser utilizada tanto para la termostatizacin como para el uso de filtros. La temperatura se control en 0.5 K por circulacin de agua destilada por la camisa con un termostato/criostato Grant modelo GD120 y se midi dentro de la celda de reaccin con un termmetro digital celsius calibrado Pt-100. Las ventanas de cuarzo de la celda son paralelas y poseen un dimetro interno de 1 cm. Para la realizacin del presente trabajo y de acuerdo con las condiciones experimentales requeridas se emple una celda con camino ptico l de 10 20 cm. El mtodo de deteccin empleado fue la espectroscopa de absorcin con la que pueden registrarse con alta sensibilidad las especies transientes generadas durante el flash. Se emple una lmpara de anlisis (LA) de Xe de arco corto XBO-75 W/2 (Osram, Alemania). La misma fue alimentada con una fuente regulada que entrega potencia constante para atenuar las fluctuaciones de impedancia que se producen en la lmpara debido a las variaciones de trayectoria que 25

experimenta el arco entre los electrodos. El haz de anlisis proveniente de la lmpara se colim y enfoc con lentes de cuarzo sobre la celda de reaccin, ubicada entre las lmparas de flash. La luz de anlisis emergente de la celda se hizo incidir sobre la rendija de un monocromador Bausch & Lomb (M). La deteccin de la seal luminosa y su conversin en seal electrnica se realiz mediante un fotomultiplicador RCA 1P28 (F). La seal del fotomultiplicador, se enva a la entrada diferencial de un osciloscopio Hewlett Packard HP 54600B (O) de 100 MHz, conectado a una PC por una interfase, permitiendo almacenar los datos para su posterior anlisis. A partir de los valores de absorbancia resuelta en el tiempo que se obtienen es posible analizar el comportamiento cintico del proceso en estudio. Para evitar la acumulacin de productos, cada solucin fue irradiada con un nico flash.

Figura 2.1: esquema de los componentes bsicos de un equipo de flash fotlisis convencional. LA lmpara de anlisis, C celda de reaccin, L lmparas de flash, Cap capacitores, M monocromador, F fotomultiplicador, O osciloscopio, T trigger, PC computadora.

Lser flash-fotlisis (LFP) Los experimentos de lser flash fotlisis se realizaron por excitacin con el cuarto armnico de un lser de Nd:YAG Litron (2 ns de ancho de pulso y 6 mJ por pulso a 266 nm). Para los ensayos se utiliz una celda de fluorescencia de cuarzo de 1 cm de lado. La luz del lser y la de anlisis se disponen en una geometra de 90. La luz de anlisis de una lmpara de arco de Xe de 150 W se hace pasar por la celda y se enfoca luego en el monocromador PTI 1695 que tiene acoplado a un fotomultiplicador 1P28 PTM. Las seales se adquirieron como el promedio de 64 pulsos, con un osciloscopio digital 500 MHz Agilent Infiniium y se transfirieron a una computadora para su posterior anlisis. El esquema se muestra en la siguiente figura. 26

Figura 2.2: esquema de un equipo de lser flash fotlisis. LA lmpara de anlisis, C celda de reaccin, L lser, M monocromador, F fotomultiplicador, O osciloscopio.

Anlisis de las trazas de flash fotlisis. En la Figura 2.3 se muestra una traza cintica tpica obtenida en los experimentos de fotlisis flash.

0%T

Voltaje / mV

xt xo

100 % T
ro isp a

tiempo

Figura 2.3: Traza tpica obtenida con el equipo de flash fotlisis convencional o lser. 27

Al analizar los resultados experimentales debemos asegurarnos que se trata del decaimiento de una nica especie. Esto puede verificarse si la cintica de decaimiento de la especie transiente es la misma para todas las longitudes de onda donde se estudia el proceso. Para convertir a absorbancia los valores de voltaje registrados por el equipo de flash fotlisis convencional, se ajusta antes de medir el 100% de transmitancia de la luz de anlisis a cada longitud de onda al valor de un voltio utilizando un comparador diferencial conectado al osciloscopio. La respuesta detectada en el osciloscopio x es proporcional a la intensidad de la luz transmitida I = K x, donde la constante K depende de la sensibilidad del detector y la seal x est expresada en mV. Combinando esta ecuacin con la ley de Lambert Beer se obtiene:
x I A t = log 0 = log 0 = l ct I xt

Ec. 2.1

Donde At es el cambio de la absorbancia al tiempo t producido por el pulso de luz, es el coeficiente de extincin molar de la especie transiente a la longitud de onda , ct es su concentracin molar al tiempo t, y l la longitud de la celda en centmetros. Como el transiente absorbe solo una pequea fraccin de luz, es necesario amplificar la ganancia del osciloscopio, por lo que la seal correspondiente al 0% de transmitancia no aparece en la pantalla del osciloscopio. 0. Para ajustar el valor de xo se toma el promedio de los valores medidos antes del flash, x
x I A t = log 0 = log 0 = l ct I xt

Ec. 2.2

En el caso de las seales registradas con el equipo de lser flash fotlisis, no se ajusta el valor de 100% de transmitancia. El valor de I0 se mide en el osciloscopio y se utiliza la ecuacin 2.2 para calcular At.

II-3. Fotlisis continua. Para los experimentos de irradiacin continua realizados en nuestro laboratorio se utiliz un fotorreactor DEMA (Mangels, Bornheim-Roisdorf, Alemania) de 750 ml y geometra anular, construido en vidrio. El reactor posee un encamisado central dentro del cual se coloca la lmpara de fotlisis empleada, por el que circula agua de refrigeracin para asegurar la disipacin del calor producido por la lmpara. Se utilizaron dos encamisados, uno construido en vidrio y el otro construido en cuarzo. Utilizando uno u otro es posible filtrar de distinta forma la luz emitida por la lmpara de fotlisis que llega a la solucin de medida. En la parte inferior del fotorreactor se encuentra una placa porosa por la cual se inyecta el gas utilizado para el mezclado de la solucin dentro del reactor. La extraccin de muestras del reactor se efecta mediante una jeringa provista

28

de una sonda de tefln a travs de una de las bocas superiores. Todo el conjunto se coloca dentro de un Termostato MGW-LAUDA modelo NB-D8/17, que permiti el control de la temperatura de las soluciones durante los experimentos de fotlisis a 27 2 C. Se emple una lmpara Philips HPK 125 W de arco de mercurio de media presin. Este tipo de lmparas presenta una serie de lneas en la regin UV/Visible cuyos anchos e intensidades relativas dependen de la temperatura y presin de trabajo. Esta lmpara consta de un tubo de cuarzo que contiene en su interior los electrodos, una cantidad de mercurio, y argn como gas de arranque. Una vez encendida la lmpara el calor liberado en la descarga comienza a evaporar al mercurio. Vaporizado todo el mercurio la lmpara entra en un estado estacionario en donde tanto la potencia emitida como la distribucin espectral de la radiacin se mantienen constantes a lo largo del tiempo. En esta lmpara se ha estimado un perodo de 90 seg. para que se alcance del estado estacionario. Con una actinometra con ferrioxalato (Kuhn y col., 2004) se determin que la lmpara emite 4.18 x 1014 fotones / s a la temperatura de trabajo. En la Tabla 2.4 se presenta el flujo radiante de la HPK125 para las lneas ms importantes (Scaiano, 1989), y en la Figura 2.4 se muestra su espectro en color azul. En la misma figura se graficaron las transmitancias porcentuales de las camisas de cuarzo (en violeta) y de vidrio (en turquesa) empleadas con los reactores. Tabla 2.4: espectro de las lmparas Philips HPK y HPLN utilizadas. / nm 248.2 253.7 265.3 269.9 280.4 289.4 296.7 302.5 313.0 334.1 365.5 407.7 / 407.8 435.8 546.1 577.0 / 579.0 Flujo Radiante/W HPK 125 0.5 2.5 1.1 0.2 0.5 0.3 0.9 1.4 3.1 0.4 5.1 1.8 3.5 4.4 3.5 Flujo Radiante/W HPLN 125 0.46 1.16 0.8 0.2 0.48 0.32 0.86 1.44 2.64 0.48 5.12 2.20 4.04 4.90

Para los experimentos de degradacin de clomazone realizados en el Laboratorio de Simulacin y Control de Procesos de la Universidad de San Pablo (Brasil), se utiliz un reactor similar al anterior con doble encamisado para el control de la temperatura. El primero, en cuyo 29

interior se coloc la lmpara, puede ser de cuarzo o de vidrio y permite adems seleccionar la longitud de onda con que irradia la solucin (las transmitancias de ambas camisas a cada longitud de onda se muestran en la Figura 2.4). El segundo est ubicado en el exterior del reactor. Se utiliz una lmpara de vapor de mercurio Philips HPLN de 125 W, cuyo espectro tambin se muestra en la Tabla 2.4 y la Figura 2.4, en color rojo.

6 5

100

Potencia radiante / W

80

4
60

3 2 1 0 200 300 400 500

40

20

600

Longitud de onda / nm
Figura 2.4: Espectros de emisin de las lmpara Philips HPK 125 (en azul) y Philips HPLN de 125 W (en rojo), y porcentajes de transmitancia de las camisas de cuarzo (lnea violeta) y vidrio de borosilicato (lnea turquesa) utilizadas en los reactores. En los ensayos con cido tricloroactico y radicales inorgnicos realizados en el Engler Bunte Institut de la Universidad de Karlsruhe (Alemania), se utiliz una lmpara cilndrica de Hg de baja presin (Heraeus Noblelight, Germany, NIQ40/18) que emite a 185 y 254 nm. El reactor tambin posee geometra anular (400 ml, 1 cm de camino ptico anular) y la camisa central es de cuarzo suprasil, que permite el paso de ambas longitudes de onda. La temperatura se control colocando el reactor en un bao termosttico a 25 C. Para filtrar la lnea de emisin de 185 nm, la lmpara se coloc en una camisa de cuarzo.

30

Transmitancia %

Generacin de los radicales inorgnicos. Para generar el radical SO4 se irradiaron soluciones acuosas de peroxodisulfato de sodio con luz UV (exc <300nm). Los radicales Cl y Cl2 se generan por las reacciones del radical SO4 con el ion cloruro y del tomo de cloro con el ion cloruro, respectivamente, segn las siguientes reacciones: S2O82 + SO4 + Cl
(a)

h Cl Cl

2 SO4 Cl Cl2 + SO42 k2 = 4.7108 M-1 s-1 (a) K3 = 1.42105 M-1 (a)

(1) (2) (3)

NDRL-NIST Solution Kinetics Database Ver. 3.0 [Ross y col., 1998] El radical anin dixido de carbono (CO2 )y el radical hidroximetilo (CH2OH) se

generaron respectivamente por oxidacin de formiato y metanol con SO4 u HO, segn las siguientes reacciones: HCO2 + HCO2 + H2CO2 H2CO2 + + SO4 HO CO2 CO2 CO2 + CO2

+ +

HSO4 H2O HSO4 + H+

k4 = 1.5 108 M- sk5 = 3.2109 M- sk6 = 5 105 M- s1 1 1 1

(a)

(4) (5) (6) (7) (8) (9)

(a)

SO4 HO

(a)

+ + +

H3O+ HSO4 H2O

k7 =1.3108 M- sk8 = 1107 M- s1 1

(a)

CH3OH + CH3OH +
(a)

SO4 HO

CH2OH CH2OH

(a)

k9 =9.7108 M-1 s-1 (a)

NDRL-NIST Solution Kinetics Database Ver. 3.0 [Ross y col., 1998]

Mientras que el radical anin superxido (O2 )y su cido conjugado (HO2) se generaron por fotlisis UVC de una solucin concentrada de agua oxigenada. H2O2 + HO + h H2O2 O2 + H+ 2 HO HO2 + H2O k11 = 2.7 107 M-1 s-1 (a) pKa = 4.8
(a)

(10) (11) (12)

HO2
(a)

NDRL-NIST Solution Kinetics Database Ver. 3.0 [Ross y col., 1998]

31

II-4.Determinacin de las concentraciones en estado estacionario de O2 (1g) y HO Las concentraciones en estado estacionario de O2 (1g) y del radical HO se obtuvieron midiendo el decaimiento de compuestos de prueba cuyas constantes de quenching (kq) se conocen [Kohn y Nelson, 2007]. Como compuesto de prueba se us alcohol furfurlico para O2(1g), y fenol para el radical HO, ambos a una concentracin final de 50 M. Se tomaron alcuotas a intervalos regulares. La concentracin de los compuestos de prueba fue monitoreada por HPLC con deteccin UV (autoinjector Waters 717 plus, detector de arreglo de diodos Waters 2996, bomba binaria Waters 1525), con una columna C18 Symmetry Waters (5 m, 4.6 x 150 mm). Como eluentes se utilizaron acetonitrilo para el alcohol furfurlico y una mezcla de 95% cido frmico 2mM y 5% acetonitrilo para el fenol. Las longitudes de onda para la deteccin fueron 220 nm y 254 nm respectivamente.

II-5. Anlisis de los productos de reaccin. Reaccin del cido glico con el radical sulfato: las soluciones de cido glico y peroxodisulfato de sodio, ajustadas a pH 3 5, fueron irradiadas con cinco descargas de las lmparas de flash fotlisis convencional para aumentar la concentracin de productos. Estas se analizaron luego por un test colorimtrico para quinonas y por HPLC/MS. El test de quinonas utilizado fue el ensayo de azul de nitrotetrazolio (NBT) / glicinato descripto por Paz [Paz y col., 1991]. 100 l de la solucin irradiada se mezclan a 4 C con 300 l de una solucin de glicinato de potasio 2M a pH = 10, 100l de una solucin de borohidruro de sodio 10 mg/ml y 1 ml de una solucin de NBT 0.24 mM preparada en glicinato de potasio 2M a pH 10. La reaccin se incuba una hora a 25 en oscuridad y se mide la absorbancia a 530 nm con el espectrofotmetro CARY 3. Para el anlisis por HPLC/MS, se utiliz un equipo modular Agilent 1100 LC-MS, de configuracin: bomba binaria, detector de arreglo de diodos y detector de masas selectivo con interfase API-ES (electrospray). La columna utilizada es una C18 5 m Restek Pinnacle II y el solvente una mezcla de metanol y agua de volmenes iguales, acidificada a pH 3 con cido actico. El flujo de solvente fue de 1ml/min y el volumen de inyeccin fue de 20 l. Los parmetros del detector de masas (MSD) fueron: API-ES en modo positivo (rango de masas 60400 unidades de masa).

32

Degradacin de clomazone: las determinaciones se realizaron en el Laboratorio de Simulacin y Control de Procesos de la Universidad de San Pablo, Brasil. La concentracin de clomazone se monitore por cromatografas lquidas de alta resolucin (HPLC) con un equipo Shimadzu 10A con una columna Luna C18(2) 5 y fase mvil metanol-agua 65:35 en un flujo de 1 ml/min, como se describe en bibliografa [Zanella y col., 2003], utilizando un detector de arreglo de diodos. Para el anlisis de los productos de degradacin se utilizaron un cromatgrafo gaseoso Shimadzu GC17A con una columna DB-5ms, acoplado a un espectrmetro de masas QP-5050A, y un cromatgrafo lquido con espectrgrafo de masas Shimadzu 2010A, con una columna Spherisorb ODS-2 5m, y la fase mvil metanol-agua (65:35, 0.2 ml/min). Para el anlisis por CG se utilizaron las siguientes condiciones: el volumen de inyeccin fue 1.0 L, la temperatura del injector fue de 250 C, el gas carrier fue He a una presin constante de 10 psi. El programa de temperatura de la columna fue: 60 C por 3 min., luego subiendo hasta 200 C a 15 C min-1, luego a 3C min-1 hasta 225 C y finalmente por 4 min. a 225 C, con un tiempo total de anlisis por muestra de 25 min. Las temperaturas de la interface y del ionizador fueron de 290 y 250 C, respectivamente. El espectrmetro de masas fue operado en modo de impacto electrnico con un potencial de ionizacin de 70 eV y los espectros fueron escaneados en un intervalo de m/z entre 50 y 650. Reaccin del cido tricloroactico con radicales inorgnicos reductores: las determinaciones se realizaron en el Engler Bunte Institut de la Universidad de Karlsruhe, Alemania. Los hidrocarburos clorados (CCl4, HCCl3. H2CCl2, C2Cl4, y C2Cl6) fueron analizados por cromatografa gaseosa en un equipo HP modelo 6890, con FID y ECD, una columna HP-5 cross-linked 5% fenilmetilsilicona. Se us He como gas portador. La temperatura se mantuvo constante a 80 C. Los productos voltiles se extrajeron con n-hexano antes del anlisis por GC. Los cidos clorados se descomponen a las temperaturas utilizadas para el anlisis por CG, por lo que fueron analizados por HPLC con deteccin UV. Los iones cloruro, clorito, clorato, perclorato, formiato y oxalato fueron analizados por cromatografa de intercambio inico con un equipo DIONEX DX500 con detector electroqumico Dionex ED 40, una columna AS9 HC Dionex, 2504 mm, con pre-columna AG 9 Dionex (504 nm). Se utiliz como eluente una solucin acuosa de Na2CO3 8 10-3 M y NaHCO3 1.8 10-3 M, con un flujo de 1.2 mL/min y un volumen de inyeccin de 25 L. Los lmites de deteccin para todos los iones son de 0.5 ppm. La identificacin cromatogrfica de todos los compuestos fue realizada por comparacin de los tiempos de retencin y por coinyeccin con patrones. Para las mediciones de Cl disuelto se utiliz un electrodo selectivo RADIOMETER 33

modelo ISE25Cl con membrana de PVC, con una impedancia de entre 5 y 100 M, una sensibilidad de 0,2 mV y un lmite de deteccin de 5.10-5 M. Como referencia se utiliz un electrodo de calomel construido en el instituto con el Dr. Rodrguez Nieto [Hills e Ives, 1969]. Para las medidas se utiliz un analizador multicanal que posee una resolucin de 0,1 mV. Una impedancia de entrada mayor a 1012 , y por lo tanto una corriente menor a 0,5 pA, garantizando medidas en condiciones cercanas al equilibrio.

II-6. Determinacin de carbono total. Se determin el carbono total (TC) con un equipo Shimadzu TOC-5000A. Este modelo posee dos canales de anlisis. Uno para la determinacin del carbono total (TC), donde todo el carbono de la muestra es oxidado a CO2 catalticamente en un horno a 680 C, y luego es transportado por medio de un flujo constante de gas portador al sistema de deteccin. En el segundo canal, usado para la determinacin del carbono inorgnico (CI), los carbonatos y bicarbonatos presentes en la muestra se convierten a CO2, acidificando a baja temperatura la solucin con una solucin de cido fosfrico. El CO2 es llevado al analizador por el mismo gas portador. Dada la relativamente baja temperatura de este canal y la ausencia de catalizador el carbono orgnico contenido en la muestra no es convertido a CO2. Antes de entrar la muestra gaseosa en la celda de anlisis, el vapor de agua es condensado y removido en el dehumificador. El analizador utiliza una fuente de radiacin infrarroja, que se divide en dos haces. Estos atraviesan las celdas pticas asociadas a la muestra y la referencia. La celda de muestra recibe el flujo del canal seleccionado que consiste en gas portador que lleva consigo los productos de reaccin de la muestra inyectada. La referencia es una celda que contiene N2, el que no absorbe en el IR. La radiacin infrarroja es absorbida por el CO2 en la celda de la muestra, y el porcentaje de la radiacin absorbida es proporcional al valor de la concentracin de CO2. Con el uso de los dos canales del instrumento se determina el carbono orgnico total (TOC) en una muestra, como la resta del valor de TC menos el de CI, TOC = TC CI. Para la calibracin se utilizaron cuatro soluciones de biftalato de potasio de concentracin conocida, preparadas por pesada.

II-7. Espectros infrarrojos con transformada de Fourier. Los espectros infrarrojos con transformada de Fourier (FTIR) se obtuvieron con un equipo Bruker EQUINOX 25. Se registraron los espectros entre 4000 y 400 cm-1 con resolucin de 34

1 cm-1. Para la preparacin de la pastilla de cada una de las sustancias hmicas, se prensa con una fuerza de 3 ton una mezcla de KBr y la muestra slida de la sustancia hmica previamente molidas. Para mejorar las seales en relacin al ruido, se promedian 64 espectros individuales para cada muestra. II-8. Matrices de excitacin emisin de fluorescencia. Los espectros de fluorescencia para la obtencin de las matrices de excitacin emisin (MEE) fueron registrados con un espectrofluorometro Perkin-Elmer LS-50B, esquematizado en la Figura 2.5. El equipo cuenta con un monocromador (de excitacin) que permite seleccionar una determinada longitud de onda de la fuente de Xe. El haz resultante se focaliza sobre la cubeta. La emisin de la muestra se detecta a 90 con respecto al haz de excitacin para evitar interferencias por efecto de la luz dispersada. El espectro de emisin se obtiene por barrido de un segundo monocromador (de emisin). El detector es un tubo fotomultiplicador R928 sensible al rojo. Las rendijas de excitacin y emisin se ajustaron a un paso de banda de 5 nm. El espectrofotmetro registra los espectros en unidades arbitrarias (UA) con un mximo de emisin de 1000 UA.

Figura 2.5: Diagrama esquemtico del sistema ptico del espectrofluormetro utilizado para la obtencin de las matrices de excitacin - emisin de fluorescencia. Los espectros de emisin obtenidos se corrigen por la respuesta del instrumento (la sensibilidad del detector y la eficiencia de los monocromadores varan con la longitud de onda). Para obtener la respuesta del instrumento se divide el espectro publicado de una sustancia de 35

referencia por el espectro de la misma sustancia registrado en nuestro equipo. Como referencias se utilizaron p-terfenilo [Du y col., 1998], pterina [Thomas y col., 2002] y rodamina B [Du y col., 1998], para obtener la respuesta del instrumento en los intervalos de longitudes de onda de 300 a 420 nm, de 370 a 600 nm, y de 520 a 800 nm, respectivamente. La correccin del espectro de emisin se realiza dividiendo el espectro experimental de cada muestra por la respuesta del instrumento. Para registrar las matrices de excitacin - emisin de fluorescencia, la longitud de onda de excitacin se incremento de a 5 nm, desde 200 a 550 nm. Para cada longitud de onda de excitacin se detect la emisin desde los 300 a los 600 nm, tomando datos cada 0.5 nm a una velocidad de 1000 nm/min. Todas las muestras se prepararon por disolucin de los slidos en agua destilada llegando a una absorbancia a 550 nm (A550nm) de 0.050 0.005.

II-9. Imgenes de pseudomicelas de las sustancias hmicas. Se investig la formacin de pseudomicelas de AHA en agua mediante el empleo de tcnicas de microscopa observando la fluorescencia a em = 650 nm de la porfirina TMPyP (Figura 2.6), que es soluble en agua y capaz de ingresar a las pseudomicelas. Se prepararon muestras a diferentes pHs y se observ tambin el efecto de la formacin de pseudomicelas en presencia de diversos electrolitos como peroxodisulfato de sodio y sulfato de cobre (II). Estos ensayos se realizaron en colaboracin con el grupo del Prof. Peter Ogilby en Aarhus, Dinamarca. El equipo utilizado consta de un microscopio invertido Olympus (modelo IX70) equipado con un detector de InGaAs de arreglo lineal (Princeton Instruments/Roper) [Andersen y col., 2002, y Zebger y col., 2003]. Se emple luz de exc = 420 nm, proveniente de una lmpara continua de Xe de 75 W, que fue acoplada a la muestra a travs del objetivo del microscopio usando un espejo dicroico. La luminiscencia resultante fue colectada por el objetivo del microscopio y transmitida a travs del mismo espejo dicroico y de un filtro de banda de longitud de onda variable hacia un detector colocado en el plano de la imagen. De esta forma se obtiene un perfil de intensidad de luminiscencia de un corte en planos a travs de la muestra. Las imgenes bidimensionales se obtienen trasladando lateralmente la muestra sobre el portaobjetos del microscopio y registrando planos sucesivos. Las imgenes se obtuvieron con un aumento de 60x. Las soluciones para las determinaciones se obtuvieron mezclando volmenes iguales de una solucin acuosa de TMPyP (A420 = 1.14) con otra solucin acuosa de 12 mg de AHA en 5 mL de agua.

36

Figura 2.6: 5,10,15,20-tetrakis(N-metil-4-piridil)-21H,23H-porfina (TMPyP)

II-10. Anlisis computacional.

Anlisis de regresin bilineal. Los espectros de los intermediarios de reaccin, se obtuvieron a partir de los perfiles de absorcin a diferentes longitudes de onda, manteniendo el resto de las condiciones experimentales. Por lo tanto la absorbancia es una funcin de la longitud de onda y del tiempo. Teniendo en cuenta la linealidad entre la absorbancia, la concentracin y el coeficiente de absorcin, este anlisis se aplica a la matriz de absorbancia experimental para obtener informacin de mnimo nmero de especies y sus respectivos perfiles de concentracin y espectro de absorcin [San Romn y Gonzalez, 1989]. La absorbancia se escribe en forma matricial [A] = [] [c], donde [A], [] y [c] representan las matrices de la absorbancia, coeficiente de absorcin molar y concentracin, respectivamente. El procedimiento se basa en el clculo de las matrices [] y [c] por regresiones lineales mltiples (utilizando la condicin de cuadrados mnimos) por iteraciones sucesivas hasta que el sistema converge, o sea se minimizan los elementos de la matriz error. A partir de la matriz error se obtiene la matriz de absorbancia corregida [Ac]. El nmero de especies es seleccionada como el mnimo valor que permite una aproximacin razonable entre [Ac] y [A].

Simulaciones cinticas. Para simular el decaimiento de las especies transientes generadas en los ensayos de flash fotlisis se utiliz un programa basado en el balance de los componentes formulado en trminos de un sistema de ecuaciones diferenciales, que se resuelven por el mtodo de Runge Kutta [Gonzalez y Braun, 1995]. Este programa considera al flash como una funcin delta que produce una 37

concentracin determinada de radical. La concentracin de radical inmediatamente despus del flash se ingresa como parmetro inicial, a partir de la estimacin experimental de la misma. Para esta estimacin se realizan ensayos en ausencia de otras sustancias con las que pueda reaccionar. Para validar el mtodo los resultados obtenidos se comparan con resultados experimentales.

Clculos tericos. La metodologa de clculo utilizada fue la teora del funcional de la densidad (Density Functional Theory, DFT) con un nivel de teora B3LYP [Becke, 1993; Lee y col., 1988] y el conjunto de bases extendidas 6-311++G** [Krishnan y col., 1980; Clark y col., 1983; Frisch y col., 1984]. Todos los clculos se realizaron con el programa GAUSSIAN03 [Gaussian 03, Revision C.02, 2004]. Las estructuras geomtricas de todas las especies e intermediarios fueron optimizadas. Luego de cada optimizacin se realiz un anlisis vibracional para confirmar que las estructuras calculadas posean realmente un mnimo de energa y para evaluar las correcciones de la energa vibracional del punto cero (zero-point energy, ZPE) y correciones trmicas a la energa libre de Gibbs, las que se incluyen en todas las energas calculadas. Para los radicales se utiliz la aproximacin de capa abierta irrestricta (unrestricted open-shell), no encontrndose contaminacin de spin (el valor de la desviacin <S2> standard calculado en todos los casos fue menor al 5% del valor terico esperado). Los efectos de solvente fueron calculados con el modelo del campo de reaccin autoconsistente continuo polarizado (self-consistent reaction field polarized continuum model, SCRF-IEF-PCM) [Miertos y Tomasi, 1982; Cossi y col., 1996; Barone y col., 1997] como lo implementa el programa de clculo Gaussian03. El programa utiliza el conjunto de radios de hidratacin UAO para formar cavidades segn la geometra molecular previamente optimizada, la hibridizacin y la carga de la especie. En este mtodo, el solvente es modelado como un continuo de constante dielctrica , y el soluto es colocado en la cavidad formada segn los parmetros mencionados dentro del solvente. El modelo no considera interacciones especficas entre el soluto y el solvente.

II-11. Determinacin de la constante de velocidad de desactivacin de oxgeno singulete. Para determinar la constante de desactivacin global de oxgeno singulete (kt) se registra la fosforescencia resuelta en el tiempo emitida por esta especie a 1270 nm. Esta tcnica permite evaluar los tiempos de vida del O2(1g) en ausencia (0) y en presencia de quencher (), monitoreando el decaimiento del mismo por fosforescencia a 1270 nm. La intensidad de la seal 38

(I) es directamente proporcional a la concentracin de O2(1g) a cualquier tiempo t y decae exponencialmente con un tiempo de vida (), segn la Ecuacin 2.3.
t

I = I0 e

Ec. 2.3

Se realizaron medidas en soluciones con diferentes concentraciones de quencher (Q) para obtener valores de en funcin de la concentracin de quencher. Se utiliz la ecuacin de SternVolmer (Ecuacin 2.4) para obtener una recta graficando 1 / contra [Q] cuya pendiente es kt .
1 1
0

+ kt [ Q ]

Ec. 2.4

Como fuente se utiliz el segundo armnico de un lser Nd:YAG (Litron) con emisin a 532 nm atenuada (2 ns de ancho de pulso y 5 mJ por pulso). La radiacin emitida es detectada perpendicularmente a la direccin del lser, usando un detector de Germanio (Judson 116 85p, de 5 mm de dimetro) provisto de un sistema interno de filtros apropiados. La seal elctrica proveniente del detector es digitalizada por el osciloscopio (500 MHz Agilent Infiniium) y almacenada. Las seales se analizan luego en una computadora. Las soluciones se prepararon en D2O de modo de obtener un valor de 0 y mucho mayores que el tiempo de resolucin del detector empleado (1 s). Como sensibilizador se utiliz Rosa de Bengala. El pH se ajust con KOH y los valores de pD se calcularon sumando 0.4 al valor de pH medido [Mrtire et al., 1993]. Para la determinacin de la constante de velocidad de desactivacin reactiva de oxgeno singulete (kR) se compar el comportamiento cintico del sustrato en estudio (S) respecto de un compuesto de referencia (Ref) cuya constante de velocidad para la reaccin con oxgeno singulete (kRRef) se conoce. En este trabajo se utiliz el mtodo descripto por Foote y Ching [Foote y Ching, 1975] que consiste en la irradiacin sensibilizada de los sustratos S y Ref en condiciones de pseudo primer orden. A partir de soluciones de concentraciones conocidas de ambas sustancias, y manteniendo constante la concentracin de sensibilizador y la geometra del sistema, se mide el consumo de O2 disuelto en funcin del tiempo de irradiacin, que puede describirse con la Ecuacin 2.5 -d[O2]/dt = kr [Q] [O2(1g)]ss 39 Ec. 2.5

Donde Q es la sustancia de estudio o la referencia, y [O2(1g)] obtiene ln ([O2]/[O2]o) = - kR t

ss

la concentracin de

O2(1g) en estado estacionario. Si esta ltima se considera constante, al integrar la Ecuacin 2.6 se

Ec. 2.6

Al graficar el ln ([O2 ]/[O2]0) contra el tiempo se obtienen lneas rectas, cuyas pendientes son proporcionales a cada constante reactiva. El valor de kRS se calcula de la relacin de las pendientes de las rectas para ambas sustancias, segn la Ecuacin 2.7.
Ref kR

k Ref kS

S R

Ref

Ec. 2.7

En estos experimentos las soluciones fueron irradiadas con una lmpara de cuarzohalgeno de 150W focalizada sobre un reactor cilndrico de vidrio (125 ml). Entre ambas se interpuso un filtro de corte (410 nm) para que slo el sensibilizador absorbiera la luz. En la parte superior se coloc un esmeril para el montaje del soporte del electrodo de oxgeno sin que quede aire en el fotorreactor. El soporte del electrodo est provisto de un pequeo buzo magntico colocado aproximadamente 1 cm debajo de la membrana del electrodo. Las soluciones se prepararon con agua destilada. Como sensibilizador se utiliz Rosa de Bengala. Se monitore el consumo de O2 disuelto con un electrodo polarogrfico Orion 97-08-99. La sustancia elegida como referencia fue el aminocido histidina, cuya constante de velocidad de reaccin se conoce (kRRef = 9.0 107 M-1 seg-1 [Miskoski y Garcia, 1993]). Se trabaj con concentraciones de ambos sustratos de 7.6 10-4 M para conservar la condicin de pseudo primer orden. En estos ensayos no se super el 15 % de conversin de reactivos, para minimizar la posibilidad de reaccin entre los productos y el O2(1g). En experimentos realizados en las mismas condiciones experimentales, se sigui la cintica de consumo de clomazone por HPLC. Para poder comparar ambos experimentos, se realizaron ensayos midiendo el consumo de ambos. Debido a que el consumo de O2 disuelto se debe realizar en un recipiente cerrado, se sigui su cintica de consumo, y a distintos tiempos finales se determin la variacin de la concentracin de clomazone por HPLC. II-12. Determinacin del rendimiento cuntico de generacin de oxgeno singulete por sustancias hmicas. 40

La produccin de oxgeno singulete (O2(1g)) sensibilizada por SH se detect empleando como fotosensibilizadores cidos hmicos de origen comercial (Aldrich, AHA) y extracto alcalino de vermicompost (Ext. OH) en agua deuterada. Debido a los bajos rendimientos cunticos de produccin de O2 (1g), , debi utilizarse un equipo de muy alta sensibilidad cuya operacin se basa en la deteccin por la tcnica de single photon counting (SPC) de la de la emisin en el infrarrojo cercano (1270 nm) producida por el decaimiento del oxgeno del estado excitado 1g al estado fundamental 3g-. Estos ensayos se realizaron en colaboracin con el laboratorio del Prof. Peter Ogilby en Aarhus, Dinamarca. La parte principal del arreglo experimental empleado es el lser de Ti:zafiro de femtosegundo (Tsunami 3941; Spectra Physics/Newport,). El lser de Ti:zafiro est bombeado por la frecuencia doblada de un lser de diodo de onda continua Nd:VO4 (Millennia V, 5W; Spectra Physics/ Newport) que opera a 80 MHz. Este lser bombea un amplificador (Spitfire) cuya funcin principal es la reduccin de la frecuencia de repeticin a 1 kHz, la que es adecuada para los experimentos de O2 (1g) debido a que su tiempo de vida en los sistemas de estudio es del orden del microsegundo. La longitud de onda de excitacin empleada en los experimentos fue 400 nm. Dado que el amplificador no emite por debajo de los 760 nm, la longitud de onda seleccionada fue de 800 nm y su frecuencia fue doblada mediante un cristal delgado de -borato de bario (BBO). La luz de 400 nm fue luego filtrada con un filtro de banda (400420 nm) que transmite el segundo armnico y bloquea el haz fundamental de 800 nm. La potencia del lser fue medida con un aparato FieldMax TO; Coherent (Santa Clara, CA). La fosforescencia de oxgeno singulete (1g 3g-) se mide colocando un filtro de banda de 1270 nm en frente del fotomultiplicador (Hamamatsu, modelo R5509-42), el que se usa en el modo de single photon counting y cuyo tiempo de respuesta es de 3 ns. El fotomultiplicador fue enfriado a 80 0C mediante un flujo de nitrgeno gaseoso que haba sido bombeado a travs de un vaso Dewar con nitrgeno lquido. La salida del fotomultiplicador fue amplificada 25 veces con un preamplificador Stanford Research Systems modelo 445; enviada a travs de un filtro casero de paso alto de bloqueado DC a un contador de fotones de dos canales (Stanford Research Systems modelo 400).

41

II-13. Ensayos microbiolgicos. Se estudi el efecto de la presencia de sustratos orgnicos ricos en sustancias hmicas y de su fotlisis, en el desarrollo de dos bacterias: una cepa de referencia de Escherichia coli (ATCC 4352) y una cepa aislada del mismo suelo del cual se realizaron los extractos. La composicin de los medios de cultivo empleados se listan en la Tabla 2.5. Los medios se esterilizaron en autoclave a 121C y 1 atm. de sobrepresin durante 20 min. El aislamiento de bacterias del suelo se realiz a partir de 5 gramos de muestras de suelo del horizonte superficial con alto contenido de humus, recolectadas en mayo de 2006 del Parque Pereyra Iraola. Las muestras se enriquecieron en 50 ml de medio de cultivo R2A y se incubaron 24 hs en agitacin (180 rpm) a 30C. Las alcuotas fueron inoculadas en agar cetrimide para aislar selectivamente bacterias del gnero Pseudomonas. Se observaron dos tipos de colonias: Cepa A de colonias color crema, grandes elevadas y difusas, y la Cepa B de colonias con pigmento verdoso, ms grandes, difusas y ms chatas. Ambas fueron bacilos Gram negativos. Se realizaron replicados en agar R3A [Reasoner y Geldreich, 1985] hasta obtener aislamientos puros. Se eligi continuar los ensayos con la cepa B. Por ltimo se hizo un repique en agar R3A en pico de flauta para guardarla a 4C. Para la preparacin de los inculos, cada cepa bacteriana se hizo crecer en caldo R3A, y se incub a 30C en un agitador rotatorio a 180 rpm por 24 hs. Tabla 2.5: composicin de los medios de cultivo empleados para los ensayos microbiolgicos. Para los medios slidos, se agreg 15 g de agar agar por litro de medio y luego se esteriliz. MML NaCl K2HPO4 (NH4)H2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4 KNO3 H2O 5g 1g 1g 1g 3g 1L R2A Extracto de levadura Proteasa peptona cidos Glucosa Almidn Piruvato K2HPO4 MgSO4 H2O 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.3 g 0.3 g 0.05 g 1L R3A Extracto de levadura Proteasa peptona Casamino cidos Glucosa Almidn Piruvato K2HPO4 MgSO4 H2O 1g 1g 1g 1g 1g 0.5 g 0.6 g 0.1 g 1L Agar cetrimide Digestin pancretica de gelatina Cetrimide MgCl2 K2SO4 Glicerol Agar agar H2O 0.3 g 1.4 g 10 g 10 ml 15 g 1L 20 g

0.2 g Casamino

42

Para los ensayos 1 ml del inculo a ensayar se agregaron a 50 ml del medio de cultivo suplementado con el respectivo sustrato orgnico, y se incub en un agitador rotatorio a 180 rpm y 30C, tomando muestras en el tiempo para seguir el desarrollo microbiano. Se utilizaron dos medios de cultivo, R2A o medio mineral (MML) ajustado a pH 6.5, con la adicin de los sustratos orgnicos (extracto de suelo y cido humico Aldrich) fotolizados o sin fotolizar. Los mismos se agregaron al medio de cultivo en relacin 1 a 1, y se esterilizaron luego en autoclave durante 20 min. a 121 C y una atm. de sobrepresin. Tambin se ensayaron los sustratos orgnicos solos y los medios de cultivo sin adicin de sustrato. La fotlisis de los sustratos orgnicos se realiz en el mismo reactor utilizado para la fotlisis continua, con camisa de vidrio para no dejar pasar luz por debajo de 320 nm. La lmpara utilizada es la Philips HPK 125 y el tiempo de irradiacin fue de 90 minutos. El crecimiento bacteriano se sigui midiendo la atenuancia (D) del medio a 600 nm. Esta se define como el logaritmo en base 10 del poder radiante incidente (P0) dividido por el poder radiante incidente (P ). La atenuancia se reduce a la absorbancia si el haz incidente no se refleja ni se dispersa, slo se transmite o absorbe.

P0 D = log P

= log(T )

Ec. 2.8

Donde T es la transmitancia. La atenuancia se correlaciona con la concentracin de bacterias expresada en UFC/ml (unidades formadoras de colonias por ml) determinada en cajas de petri con R3A slido. La cintica de crecimiento se ajust con la ecuacin de Gompertz [Zwietering y col., 1990]. e ( L t ) f = y0 + A exp exp max + 1 A Ec. 2.9

Donde f = ln (Dt / D0); A = ln (D / D 0); max es la velocidad de crecimiento en la fase exponencial; y L es el perodo de latencia.

43

Resultados

Captulo III. Extraccin y caracterizacin de sustancias hmicas de vermicompost.

Extraccin de materia orgnica a partir de vermicompost.

Se optimiz el proceso de extraccin de sustancias hmicas (SH) a partir de vermicompost de origen comercial (Establecimiento Don Astor). El compost es el proceso resultante de la accin de lombrices rojas californianas (Eisenia foetida) sobre camas de estircol de ganado vacuno durante un perodo de tres meses. En la Tabla 3.1 se listan algunas caractersticas fisicoqumicas del compost (determinaciones realizadas en la ctedra de Edafologa de la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales de la UNLP.) Tabla 3.1: propiedades fisicoqumicas del compost comercial. Anlisis pH Conductividad Carbono orgnico Materia orgnica Fraccionamiento de la MO Nitrgeno total Relacin C / N Fsforo total Cenizas Humedad Colorimetra con (NH4)2MoO4 Incineracin en mufla a 600 C Secado en estufa a 105 C Micro Kjeldahl Mtodo En pasta Conductimetra Walkley-Black Incineracin. Stevenson c. Hmicos c. Flvicos Huminas Valor 6.2 5.6 18.6 % 37.7 % 50.4 % 18.6 % 31.0 % 1.5 % 12.5 0.4 % 62.3 % 8.3 %

La extraccin se realiz suspendiendo 40 g de compost en 250 ml de solucin acuosa alcalina ajustada a pH 9.0 con hidrxido de sodio. La suspensin se mantuvo en agitacin constante durante 1 hora. Se tomaron 50 ml de la solucin y se evaporaron hasta sequedad en rotavapor a presin reducida y 40C. El slido obtenido se llev a peso constante en estufa a 60o C. La masa del slido seco obtenida a partir de esta alcuota fue de 0.1014 g, y la concentracin del extracto es de 2.03 g L-1. 44

Caracterizacin de las distintas sustancias hmicas utilizadas.

En este trabajo se emplearon muestras de cidos hmicos comerciales Aldrich (AHA) y de turba de Waskish de la International Humic Substances Society (AH IHSS), cido flvico de turba de Waskish de la IHSS (AF IHSS), y extractos de vermicompost (Ext. OH) y de suelo (Ext. S). Los contenidos de carbono y nitrgeno de las muestras de SH empleadas se listan en la Tabla 3.2 Tabla 3.2: Contenido de carbono de las muestras de SH comerciales y los extractos de materia orgnica. Muestra AHA AHA pufif AH IHSS AF IHSS Ext. OH Ext. S
(a)

%C 42 1(a) 44.1(c) 46 2 65 2 16 2 29 1

%N 0.9 (b) ND 1.5 (b) 1.1 (b) ND 2.5 0.1

C/N 46.7 ND 30.7 59.1 ND 11.5

Valores en el rango 38.5 - 44.1 fueron informados por Kollist-Siigur y col. 2001, Landgraf y col. 1999. (b) Valores suministrados por los proveedores. (c) Palazzi y col, 2007. ND: no determinado. Matrices de emisin-excitacin de fluorescencia (MEEF): Se prepararon soluciones acuosas de las distintas SH, se ajust el pH a 7.0 0.1 y la absorbancia a 550 nm a 0.050 0.005. Se registraron los espectros de emisin de fluorescencia excitando las muestras a distintas longitudes de onda entre 200 y 550 nm con incrementos de 5 nm. Los espectros obtenidos se corrigen por la respuesta del instrumento y se grafican en 3 dimensiones para obtener las matrices. Las matrices pueden dividirse en 5 regiones (Figura 3.1). Los picos en cada regin se han asignado a compuestos orgnicos del tipo hmicos, flvicos, tirosnicos, triptofnicos o fenlicos, [Chen y col. 2003; Coble, 1996; Coble y col., 1993; Coble y col,. 1990]. En general, picos a longitudes de onda de excitacin cortas (<250 nm) y longitudes de onda de emisin cortas (<350 nm) se asocian al aminocido tirosina y a protenas simples con alto contenido de este tipo de aminocidos aromticos (Regiones I y II) [Ahmad y Reynolds, 1999; Determann y col., 1994]. Picos correspondientes a longitudes de onda de excitacin corta (< 250 nm) y a mayores longitudes de onda de emisin se relacionan con los cidos flvicos (Regin III) [Mounier y col., 1999 (a)]. Los picos que corresponden a longitudes de onda de excitacin intermedias (250-280 nm) y longitudes de onda de emisin cortas (< 380 nm) estn relacionados a productos solubles de degradacin microbiana (Regin IV) [Coble, 1996, Ismaili y col, 1998; 45

Reynolds y Ahmad, 1997]. Picos a longitudes de onda de excitacin ms largas (> 280 nm) y tambin longitudes de onda de emisin ms largas (> 380 nm) estn relacionados con la presencia de cidos hmicos (Regin V) [Artinger y col., 2000; Miano y col., 1990; Mounier y col., 1999 (b)]. Datos de MEEF para longitudes de onda menores que 240 nm no han sido ampliamente publicados, aunque pueden ser medidos en forma confiable con los avances recientes que proveen fuentes de excitacin estable a estas longitudes de onda.

400

350

exc (nm)

300

IV

250

I
200 300

II
350 400

III
450 500 550

em

(nm)

Figura 3.1: Regiones de la MEEF mencionadas en el texto. En las Figuras 3.2 y 3.3 se muestran respectivamente las MEEF obtenidas con las SH comerciales y las extradas en el laboratorio.

46

550 500 450

exc

400 350 300 250 200 300

350

400

450

500

550

600

550 500 450

em

550

500 450

exc

350 300 250 200 300

exc
350 400 450 500 550 600

400

400 350 300 250 200 300

350

400

450

500

550

600

em

em

Figura 3.2: MEEF de las SH comerciales en solucin acuosa a pH 7. 1) AHA, 2) AF IHSS, 3) AH IHSS. Las lneas rojas son luz de excitacin de primer y segundo orden y Raman del agua.

550 500 450

550

500 450

exc

350 300 250 200 300 350 400 450 500 550 600

exc

400

400 350 300 250 200 300 350 400 450 500 550 600

em

em

Figura 3.3: MEEF de las SH extradas a partir de vermicompost (1) y de suelo (2), en solucin acuosa a pH 7. Las lneas rojas son luz de excitacin de primer y segundo orden y Raman del agua.

47

Las matrices de los extractos de vermicompost y de suelo muestran que la principal fluorescencia se enmarca en las regiones IV y V que corresponden a productos solubles del metabolismo microbiano y a los cidos hmicos, respectivamente. Mientras que las SH comerciales muestran fluorescencia en todas las zonas (incluidas las zonas III y V, correspondientes a los cidos flvicos y hmicos respectivamente). La MEEF del Ext. OH muestra mximos de fluorescencia excitando a 320 nm con emisin entre 350 y 360 nm (regin IV) y a exc = 355 y em entre 450 y 465 (regin V), mientras que para el Ext. S aparece excitando a 390 con emisin entre 475 y 485 nm. Para el AHA el mximo se encuentra en la regin de exc = 205 nm emitiendo entre 320 y 370 nm. De las SH de la IHSS, el AH muestra una zona de fluorescencia intensa a exc entre 315 y 340 nm con emisin entre 460 y 485 nm, y el AF para exc entre 230 y 240 nm emitiendo entre 460 y 470 nm. Christl y colaboradores [Christl y col., 2000] investigaron la relacin entre la heterogeneidad qumica de las SH extradas de suelo en relacin con su peso molecular, para lo cual emplearon un esquema de fraccionamiento usando ultrafiltracin por fibra hueca obteniendo fracciones de 10-30 kDa, 30-100 kDa, 100-300 kDa y mayores a 300 kDa, y se analizaron las fracciones obtenidas por anlisis elemental y distintas tcnicas espectroscpicas (espectroscopia UV-Visible, resonancia magntica nuclear de
13

C, FT-IR, y fluorescencia). Estos autores

encontraron que la MEEF de los cidos flvicos exhibe un pico a longitudes de onda de excitacin y emisin menores que los cidos hmicos [Christl y col., 2000]. Este comportamiento se atribuye a la presencia de fracciones formadas por sistemas condensados de alto peso molecular con sustituyentes aceptores de electrones y a un mayor grado de conjugacin en los cidos hmicos [Senesi y col., 1991; Mobed y col., 1996]. En tanto, un bajo grado de policondensacin aromtica, pequeas cantidades de cromforos conjugados y la presencia de sustituyentes dadores de electrones en la estructura de los cidos flvicos contribuyen a las longitudes de onda de excitacin y emisin relativamente bajas y altas intensidades de fluorescencia observadas en comparacin con los cidos hmicos [Senesi y col., 1991; Mobed y col., 1996]. Se observa un aumento en las longitudes de onda del mximo de excitacin y emisin con la disminucin del peso molecular de las distintas fracciones de cidos hmicos [Christl y col., 2000]. Este corrimiento al rojo de los mximos de fluorescencia con la disminucin del peso molecular de las fracciones de cidos hmicos se corresponde bien con el % de C aromticos determinado por resonancia magntica nuclear de
13

C. La gran diferencia entre los espectros de

fluorescencia de las fracciones de menor peso molecular de cidos hmicos con las de cidos flvicos sugiere entornos qumicos diferentes a pesar de que ambas fracciones presentan distribuciones de peso molecular similares.

48

Espectroscopa infrarroja con transformada de Fourier (FTIR). En las Figuras 3.4 y 3.5 se muestran los espectros de absorcin IR obtenidos para las muestras de SH comerciales y extradas, respectivamente.

0.50 0.45 0.40

AHA

Transmitancia

0.20

0.18

0.16

AH IHSS

0.15

AF IHSS
0.10 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
-1

500

Nmero de onda / cm

Figura 3.4: Espectros de FTIR de las muestras de SH comerciales. En la Tabla 3.3 se listan las principales bandas de absorcin en el IR para las SH y su asignacin a los diferentes grupos funcionales [Andjelkovic y col., 2006; Song y col., 2001; Amir y col., 2003; Lguirati y col., 2005; Samios y col., 2007].

49

0.4 0.3

Transmitancia

0.2 0.5

Ext. OH

0.4

0.3 4000 3500 3000 2500 2000 1500

Ext. S
1000
-1

500

Numero de onda / cm
Figura 3.5: Espectros de FTIR de las muestras de SH extradas.

La banda de absorcin IR ms importante en todas las muestras analizadas es la que se centra alrededor de los 3400 cm-1 y corresponde al estiramiento del enlace O-H de los grupos alcohol aliftico, fenol o cido carboxlico [Andjelkovic y col., 2006]. Las bandas a 2920 y 2850 cm-1 [Andjelkovic y col., 2006; Song y col., 2001] son caractersticas de los estiramientos de los enlaces C-H. La absorcin a 1720 cm-1 se asigna al estiramiento del enlace C=O de los grupos COOH. Las bandas que aparecen entre 1600 y 1650 cm1 son debidas al estiramiento del enlace C=O en carboxilatos, cetonas y cidos carboxlicos. El pico a 1400 cm1 es debido al bending del enlace C-H aliftico y al estiramiento asimtrico del COO. Las bandas en 1511 y 1540 cm-1 son debidas al estiramiento del enlace C=C y a deformaciones del enlace N-H.

50

Tabla 3.3: bandas de IR y su asignacin Nmero de onda (cm-1) 775-975 1030-1080 Asignacin de la banda Bending fuera del plano del CH aromatico. Estiramiento polisacaridos 1170 1200-1260 Vibraciones del grupo alcohol. Estiramiento COH de grupos aromticos y estiramiento COC de teres arlicos y fenoles. 1380-1400 Deformacin de los OH, estiramiento CO de fenoles, estiramiento anti-simmetrico COO- y deformacin CH en alifaticos. 1440-1460 Deformacin CH alifaticos en acidos grasos y grasas durante el proceso de compostaje. 1510- 1540 1580-1600 Estiramiento C-C de aromticos, deformacin NH. Estiramiento C=N en amidas secundarias y C=O en quinonas, cidos cetonicos y amidas 1630- 1650 Estiramiento C=C de aromticos, estiramiento C=O en quinonas, cidos cetonicos y amidas primarias. 2680- 2685 2850 2920-2930 3300- 3500 Estiramiento de OH con puentes de H. Estiramiento asimtrico C-H de CH3 y CH2 en cadenas alifticas. Estiramiento C-H aliftico (simtrico y asimtrico) de CH3 y CH2. Vibraciones de los grupos OH de fenoles, alcoholes y cidos carboxlicos y vibraciones de los NH de amidas y aminas. Los valores del grado de aromaticidad pueden calcularse a partir de los cocientes de los picos a 1650/2920 y 1650/2850, y del grado de policondensacin (1034/2920, 1034/2850 y 1034/1540) [Amir y col., 2003] para cada una de las muestras se listan en la Tabla 3.4. El pico a 1650 se debe principalmente al estiramiento de los dobles enlaces conjugados de los compuestos aromticos. Los picos a 1540, 2850 y 2920 cm-1 se deben a los compuestos alifticos, y sirven de referencia del contenido de C aliftico. El pico en 1034 cm-1 se asigna fundamentalmente a la presencia de estructuras aromticas policondensadas del tipo de las ligninas [Amir y col., 2003]. COC de teres aromticos, carbohidratos y

51

Tabla 3.4: relacin de las intensidades de absorbancia de los picos en los espectros FTIR obtenidos con las diferentes SH. Sustancia Hmica AHA AF IHSS AH IHSS Ext. OH Ext. S 1034/ 1540 0.914 1.014 0.985 0.919 0.992 1034/ 2850 0.902 1.020 0.968 1.009 0.973 1034/ 2920 0.872 0.998 0.957 0.981 0.938 1650/ 2850 1.047 1.078 1.010 1.310 1.056 1650/ 2920 1.012 1.055 0.999 1.273 1.018 1511 /2920 0.936 0.987 0.972 1.094 0.940 1650/ 1540 1.061 1.072 1.027 1.193 1.077 1720/ 2920 0.884 1.109 1.013 1.032 0.935

La secuencia de aromaticidad obtenida del anlisis de los espectros FTIR es: AH IHSS < AHA Ext. S < AF IHSS < Ext. OH; mientras que la tendencia en el grado de policondensacin es: AHA < Ext. S Ext. OH AH IHSS < AF IHSS. Se observ que existe correlacin entre el grado de policondensacin y la aromaticidad en las muestras analizadas. Espectroscopa UV-visible En la Figura 3.6 se muestran los espectros UV-visible de las diferentes muestras de SH, obtenidos a pH 7. De los mismos se obtuvo la relacin E4/E6, como el cociente entre las absorbancias a 465 nm sobre el valor a 665 nm. Dicho parmetro es muy utilizado en la caracterizacin de la materia orgnica disuelta y en la comparacin de SH de diferentes orgenes. Este cociente es independiente de la concentracin de la sustancia hmica en la solucin. La absorbancia a mayores longitudes de onda es indicativa de la presencia de molculas de mayor tamao, por lo que los valores del cociente E4/E6 se correlacionan inversamente con el peso molecular de las SH [These, 2005] y con el contenido de anillos aromticos [Lguirati y col., 2005]. Por otro lado E4/E6 correlaciona positivamente con el nmero de grupos cidos carboxlicos [Chen y col., 1977]. Como el pH de la solucin afecta el peso molecular promedio, el cociente E4/E6 depende del pH y las comparaciones con diferentes SH deben hacerse midiendo los espectros con soluciones a un mismo valor de pH.

52

2.0

1.5

Absorbancia

1.0

0.5

0.0 300 400 500 600 700 800

/ nm
Figura 3.6: espectros UV-visible de soluciones acuosas de las distintas SH de concentraciones 20 mg L-1, ajustadas a pH 7. AHA (negro), Ext. S (rojo), Ext. OH (verde), AH IHSS (amarillo), AF IHSS (azul). Las relaciones E4/E6 para todas las muestras listados en la Tabla 3.5 siguen la siguiente tendencia: Ext. OH < Ext. S < AHA < AF IHSS < AH IHSS. Se observ una correlacin inversa entre el cociente E4/E6 y el grado de policondensacin determinado por FTIR. Tabla 3.5: parmetros espectroscpicos de las diferentes SH. Sustancia Hmica AHA AH IHSS AF IHSS Ext. S Ext. OH Conc (mg L-1) 16.1 19.8 23.1 18.9 26.3 A465 0.1133 0.0923 0.1627 0.1697 0.1207 A665 0.0153 0.0111 0.0174 0.0332 0.0285 E4/E6 7.41 8.32 9.35 5.11 4.24

Imgenes de pseudomicelas de las sustancias hmicas Se investig la formacin de pseudomicelas de AHA en solucin por microscopa detectando la fluorescencia de TMPyP a em = 650 nm. Se prepararon muestras a diferentes pHs y se observ tambin el efecto de la formacin de pseudomicelas en presencia de diversos 53

electrolitos como peroxodisulfato de sodio y sulfato de cobre (II). El agregado de peroxodisulfato se hizo para observar si en las condiciones experimentales en las que se realizaron los ensayos con radicales inorgnicos oxidantes (ver captulo siguiente), las SH son capaces de asociarse y formar agregados. El agregado de iones Cu+2 se realiz porque se conoce que estos iones son capaces de favorecen la generacin de agregados desordenados del tipo de las pseudomicelas [Baalousha y col., 2006]. Estos ensayos se realizaron en el laboratorio del Prof. Peter Ogilby en Aarhus, Dinamarca. Si bien las SH fluorescen, los blancos en los que la solucin de AHA se mezcl con un volumen igual de agua destilada, no presentaron emisin a 535 nm. El ajuste de pH de las muestras se hizo con HNO3 o NaOH. Las imgenes que dicen PS contienen 0.01 M de Na2S2O8 y las que dicen Cu contienen 0.1 M CuSO4. Los resultados se muestran en la Tabla 3.6. Se observa que sin agregado de sales, a pH = 4 el tamao de las pseudomicelas es ms pequeo que a otros pHs. No se encontraron pseudomicelas ms grandes que las que se muestran en la foto en todo el preparado. En cambio a pH 6 y 10 se encontraron pseudomicelas grandes y pequeas (ver fotos). Se observa que el agregado de Na2S2O8 en concentraciones del orden de las empleadas en los experimentos de flash-fotlisis aumenta el tamao de las pseudomicelas formadas a pH 4, cuando en ausencia de peroxodisulfato solo se observaron pseudomicelas pequeas a ese pH. Adems, en presencia de peroxodisulfato se ven pseudomicelas muy brillantes, las que contienen mayor concentracin de la porfirina dentro de ellas. Esto puede explicarse por la asociacin entre el S2O82 y el AHA, lo que incrementa la cantidad de cargas negativas dentro de la pseudomicela, capaces de interaccionar con la porfirina cargada positivamente. Por otro lado, en presencia de Cu(II) el tamao de los agregados es ms grande que los observados en presencia de Na2S2O8 o a pH 6. [Baalousha y col., 2006; Andelkovi y col., 2004; Engebretson y von Wandrusrka, 1997]. En el ensayo en presencia de Cu(II) por emisin no pudo observarse nada. Se ha descrito para otros cationes divalentes (Zn, Pd) la formacin de un complejo con el TMPyP, que disminuye o desactiva la fluorescencia de la porfirina [Anula y col., 2006]. Se publicaron tambin resultados similares de desactivacin de la fluorescencia de porfirinas por iones Cu(II) [Weng y col., 2007].

54

Tabla 3.6: imgenes microscpicas de las pseudomicelas de AHA obtenidas en diferentes condiciones experimentales. Muestra Imagen de transmisin Imagen de fluorescencia

AHA pH 4

AHA pH 6 pequeas

AHA pH 6 grandes

AHA pH 10 pequeas

AHA pH 10 grandes

55

Tabla 3.6, continuacin: imgenes microscpicas de las pseudomicelas de AHA obtenidas en diferentes condiciones experimentales. Muestra AHA pH 4 PS pequeas Imagen de transmisin Imagen de fluorescencia

AHA pH 4 PS grandes

AHA pH 4 PS brillantes AHA pH 4 Cu

56

Caracterizacin de los radicales libres generados por fotolisis de soluciones de sustancias hmicas comerciales y del extracto.
Se fotolizaron soluciones de SH en diferentes condiciones para estudiar la generacin de radicales libres y determinar su reactividad. Radical hidroxilo: La generacin de radicales hidroxilo (OH) se evidenci a partir de la formacin del radical oznido (O3), en soluciones saturadas en O2 de pH fuertemente alcalino. Esto es posible debido a que en esas condiciones experimentales tienen lugar las siguientes reacciones: h SH

H2O

HS

OH

H+

[Richard y Canonica, 2005]

OH + OH

O + H2O O3 ( max = 430 mn)

K = 4.0105 [Gonzalez y col., 1998] K = 7.2105 M-1 [Gonzalez y col., 1998]

O + O2

El radical O3 se caracteriz por su espectro, comparando el obtenido experimentalmente con el publicado en bibliografa [Sehested y col., 1982; Felix y col., 1967], tal como se muestra en la Figura 3.7. Tambin se realiz el anlisis cintico del decaimiento del radical O3 a = 430 nm en condiciones de saturacin en O2, N2, aire, y en presencia de 110-3 M de tolueno saturado de O2, como se observa en la Figura 3.8. El agregado de tolueno compite con el oxgeno molecular por el radical hidroxilo, segn la reaccin. OH + Tolueno Productos k = 5.1109 M-1 s-1 [Roder y col, 1990]

57

100

Absorbancia relativa

80 60 40 20 0 350 400 450 500

/ nm
Figura 3.7: Espectro del radical O3 obtenido por fotlisis de soluciones acuosas de AHA (crculos verdes) o el extracto alcalino de vermicompost (cuadrados rojos), ajustadas a pH 13 y saturadas en O2, comparados con el publicado en bibliografa (lnea negra).

0.008 0.006

Abs

0.004 0.002 0.000 0.00

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

t / seg
Figura 3.8: Decaimientos del radical O3 a anal = 430 nm, formado por fotlisis de AHA en

soluciones acuosas de pH 11 saturadas en O2 (lnea verde), en O2 con 110-3 M tolueno (lnea roja), y en aire (lnea azul).

58

Electrn hidratado: Se realizaron ensayos de flash-fotlisis para obtener el espectro del electrn hidratado e(ac). Se midieron los cambios de absorbancia a 700 nm de soluciones de AHA saturadas en Ar (para eliminar el oxgeno disuelto), con una celda de 25 cm de camino ptico. Sin embargo en estos experimentos no se vieron seales, debido a la alta reactividad del e(ac) con las SH y el oxgeno que pudo haberse disuelto durante el ensayo. Por ello se evidenci su formacin indirectamente, mediante su reaccin con el cido tricloroactico (ATCA) para liberar iones cloruro, proponiendo el mecanismo: SH
1

HS*

ISC

HS* e(ac)

[Cooper y col., 1989] [Cooper y col., 1989] [Cooper y col., 1989]

HS* o 3HS* H2O

[SH+ + e] SH+ +

[SH+ + e ]+

Para varias sustancias cloradas se propuso: e(ac) + RHCl

RH

Cl

[Hoigne y col., 1989]

Es de esperar que en presencia de oxgeno esta reaccin se vea inhibida por la reaccin e(ac) + O2 O2 k = 1.91010 M-1 s-1 [Elliot, 1989]

Se realizaron ensayos de irradiacin continua con luz de > 250 nm de soluciones de ATCA, con o sin AHA y en diferentes concentraciones de O2. Se observ que en ausencia de SH, el ATCA no se degrada. En presencia de AHA, el ATCA se mineraliza eficientemente, tanto en ausencia como en presencia de O2. Sin embargo, slo en ausencia de O2 se observa liberacin del cloro orgnico como Cl, indicando la participacin del e(ac).

59

0.0012 0.0010 0.0008

[C l ]

0.0006 0.0004 0.0002 0.0000 0 20 40 60 80 100

Tiempo / min
Figura 3.9: Evolucin temporal de la concentracin de cloruro durante la irradiacin de soluciones

acuosas de ATCA 1 10-3 M (en verde), o la misma solucin con 20 ppm de AHA, saturada en aire (en azul) o en Ar (en rojo).

Radicales superxido e hidroperxido: Se estudi la generacin de los radicales superxido (O2 )e hidroperxido (HO2), que se encuentran en equilibrio cido-base. Para ello se realizaron experimentos de fotosensibilizacin de SH en diferentes condiciones de pH y concentracin de oxgeno molecular disuelto. Las reacciones que generan estos radicales, aparte de las mostradas en el punto anterior, son:
3

SH* + SH* +

O2 O2

SH+ +
1

O2 O2(1g) O2 RNH2+ O2

[Cooper y col., 1989] [Richard y Canonica, 2005] [Cooper y col., 1989] [Cooper y col., 1989] [Richard y Canonica, 2005] K = 3.310-5 M-1 [Gonzalez y col., 1998]

SH* +

SH + O2(1g)
3

SH+ + SH + SH + HO2

En presencia de grupos amino presentes en las SH, se produce la reaccin SH* + RNH2 O2 H+ SH +

O2 +

(max = 245 mn)

(max = 225 mn)

60

Los radicales O2 / HO2 se caracterizaron mediante el anlisis de sus decaimientos en distintas concentraciones de O2 disuelto (solucin saturada en aire y en oxgeno), a distintos valores de pH (3, 7 y 9). Tambin se obtuvo el espectro del radical HO2 a partir de la irradiacin de soluciones de cido hmico Aldrich o del extracto alcalino de vermicompost (ambas ajustadas a pH 3 y en concentraciones 1 ppm) saturadas en oxgeno, el cual se compar con el de bibliografa [Bielski y Ritcher, 1977], como se muestra en la Figura 3.10. Con nuestro equipo y diseo experimental no pude medir por debajo de 240-250 nm, debido a que a esas longitudes de onda la lmpara de anlisis posee baja potencia, el fotomultiplicador poca respuesta y la muestra de SH alta absorbancia.

100

Absorbancia relativa

80 60 40 20 0 200

250

300

/ nm
Figura 3.10: Espectros del radical HO2 obtenido del anlisis bilineal de decaimientos por fotlisis

de soluciones de cido hmico Aldrich (crculos verdes) y del extracto alcalino de VC (cuadrados rojos) saturadas en O2, a pH 3. La lnea azul representa el espectro publicado para este radical.

Oxgeno singulete: La produccin de oxgeno singulete (O2(1g)) sensibilizada por SH se detect empleando como fotosensibilizadores cidos hmicos de origen comercial (Aldrich, AHA) y extracto alcalino de vermicompost (Ext. OH) en agua deuterada. Debido a los bajos rendimientos cunticos de produccin de O2 (1g), , debi utilizarse un equipo de muy alta sensibilidad cuya operacin se basa en la deteccin por la tcnica de single photon counting (SPC) de la de la emisin en el infrarrojo cercano (1270 nm) producida por el decaimiento del oxgeno del estado excitado 1g al
61

estado fundamental 3g-. Estos ensayos se realizaron en el laboratorio del Prof. Peter Ogilby en Aarhus, Dinamarca. Se emplearon soluciones saturadas en aire del AHA y del Ext. OH, ambas de A400 = 0.61 0.01. Los decaimientos obtenidos en ambos casos se muestran en la Figura 3.11. Las seales de fosforescencia de las soluciones se ajustan a un decaimiento monoexponencial con valores de vida medias de O2 (1g) obtenidas en D2O de 62 s, los que coinciden con los valores publicados en dicho solvente [Wilkinson y col; 1995]. Con el objeto de determinar el valor de para el extracto se tomaron seales de fosforescencia a diferentes potencias del lser empleando el mtodo comparativo [Ogilby y Foote; 1982]. As, las amplitudes de las seales extrapoladas a tiempo cero (Io) para ambas muestras (AHA y Ext. OH) se graficaron en funcin de la potencia del lser obtenindose las rectas que se muestran en la Figura 3.12.

1200 1000

Cuentas

800 600 400 200 0 0 20 40 60 80 100 120

Tiempo / s
Figura 3.11: Decaimiento de fosforescencia de O2((1g) a partir de la fotosensibilizacin por AHA

(en rojo) o el extracto alcalino (en negro). El valor de Io es proporcional a la potencia del lser, a la fraccin de luz absorbida (1- 10-A) y a [Paul y col., 2005]. Los valores de para las SH disminuye al aumentar la longitud de onda de excitacin [Scully y col., 1997, Haag y Hoign, 1986]. El rendimiento cuntico de produccin de oxgeno singulete del AHA disminuye de 2.010-3 a 1.110-3 cuando la longitud de onda de la luz de irradiacin aumenta de 365 a 434 nm. [Haag y col, 1984]. Por lo tanto, a partir del cociente de las pendientes de las lneas rectas mostradas en la Figura 3.12 para los dos sensibilizadores y del valor de para AHA se estim el para EAVC, obtenindose el valor de (1.3 0.1)10-3.

62

6000

Cuentas

4000

2000

0 0 1 2 3

Potencia / mW
Figura 3.12: Grfico de Io en funcin de la potencia del lser para el AHA (en rojo) y el extracto

alcalino de vermicompost (en negro) Las SH actan no slo en la produccin de O2(1g), sino tambin en su decaimiento [Hessler y col., 1996]. Por lo que el valor aparente de estar determinado por la presencia de cromforos que generan O2(1g) como sensibilizadores y de grupos reactivos que acten de quenchers. En las condiciones experimentales empleadas, el tiempo de vida del O2(1g) observado,
, coincide con el valor reportado en D2O, lo que indica que el quenching es despreciable. Haag y

Hoign demostraron que las fracciones de menor peso molecular poseen rendimientos cunticos de produccin de O2(1g) mayores, basados en ensayos de fraccionamiento de SH de diferentes orgenes por cromatografa de exclusin molecular en gel [Haag y Hoign., 1986]. Por lo tanto, el valor de depende tanto de la longitud de onda de excitacin como de las caractersticas y concentracin de las SH.

63

Captulo IV.- Reactividad de sustancias hmicas con radicales oxidantes.

Para estudiar de que manera afecta a los tratamientos oxidativos de degradacin de contaminantes in situ (ISCO) la presencia de materia orgnica en suelos y aguas naturales se investig la reaccin de las sustancias hmicas (SH) con distintos radicales oxidantes. Se trabajo con SH de origen comercial y extradas en el laboratorio a partir de compost de lombriz, con los radicales aniones sulfato (SO4 )y bicloruro (Cl2), y el tomo de cloro (Cl). El primero es uno de los radicales ms usados en las tecnologas ISCO [Huling y Pivetz, 2006]. Los dos radicales de cloro son generados durante los tratamientos oxidativos de ambientes naturales con elevado contenido de iones cloruro [Buxton y col., 1999; Buxton y col., 1998; Huie y Clifton, 1990; Jayson y col., 1973].

a.- Radical anin sulfato.

Se realizaron ensayos de flash-fotlisis convencional de soluciones acuosas de peroxodisulfato 110-2 M en el intervalo de temperaturas de 283.2 a 303.2 K. En estas condiciones se observ la formacin de una especie que absorbe entre 300 y 550 nm, cuyo espectro y cintica de decaimiento coinciden con los publicados en bibliografa para el radical SO4[ McElroy y Waygood 1990; Choure y col, 1997] (Figura 4.1), y por lo tanto se pueden asignar a esta especie las trazas observadas. En las condiciones experimentales utilizadas, el radical SO4 decae con una cintica mixta de primer y segundo orden simultneas, con constantes de velocidad kprim (la constante de velocidad del radical con el agua, con los iones oxhidrilo y peroxodisulfato, reacciones 1 a 3) y kseg (la constante de velocidad del proceso de recombinacin, reaccin 4), respectivamente. El factor de peso para cada proceso depende de la intensidad del flash y de la concentracin de peroxodisulfato [McElroy y Waygood 1990]. Las trazas de absorbancia fueron ajustadas con la Ecuacin 4.1:

A(t , ) =

k prim b( ) exp(k prim t ) c( )

+ d ( )

Ec. 4.1

Donde A(t,) es la absorbancia en funcin del tiempo y la longitud de onda, c() = 2 kseg /() l (con () = el coeficiente de absorcin a esa longitud de onda y l = camino ptico), b() = c() + kprim / Ao() (con Ao() la absorbancia inmediatamente despus del flash), d() es la
64

absorbancia a tiempos muy largos y corresponde a la formacin de productos estables de reaccin. Para los experimentos en ausencia de sustancias hmicas, este trmino es nulo. En los ensayos en presencia de las distintas SH toma valores muy pequeos. Tabla 4.1: reacciones que intervienen en el decaimiento del radical SO4( constantes de velocidad obtenidas de NIST, [Ross y col., 1998]), en solucin acuosa en ausencia de SH. SO4 + SO4 + SO4 + SO4 + H2O OH

OH + SO42 + H+ OH + SO42 + H+

6.6 102 s-1 1.4 107 M-1 s-1 6.3 105 M-1 s-1 1.6 108 M-1 s-1

(1) (2) (3) (4)

S2O82 SO4

S2O8 + SO42 S2O82

El valor obtenido para kseg. a 293 K es de 4.7 108 M-1s-1, en concordancia con los valores publicados en bibliografa en similares condiciones (pH = 4.5, I = 3 103 M) [Ross y col., 1998]. El valor de la constante de primer orden kprim a 293 K obtenido es 1.7 103 s-1, similar a otros obtenidos por nuestro grupo [Bosio y col., 2005]. Esta constante engloba, como ya se dijo, las reacciones del radical SO4 con el agua y con los iones S2O82 y OH. Valores similares para dicha constante global en condiciones experimentales muy similares han sido publicados por Buxton (1500 s-1 [Buxton y col., 2000]).

100 80

Abs

60 40 20 0 300 350 400

/ nm

450

500

550

Figura 4.1: Espectro de absorcin normalizado inmediatamente despus del flash, correspondiente al valor de A() a tiempo cero obtenido del ajuste de la eq. 1, parar soluciones de Na2S2O8 0.01 M en ausencia de SH () y en presencia de 400 gL-1 de AHA (). La lnea slida representa el espectro de bibliografa para el radical sulfato [McElroy y Waygood 1990].

65

El anlisis de las trazas obtenidas con soluciones de Na2S2O8 1 10-2 M a diferentes temperaturas en el intervalo estudiado permite calcular las energas de activacin para los procesos englobados en las dos constantes de velocidad. Los grficos de Arrhenius para kprim y kseg se muestran en la Figura 4.2. A partir de las pendientes de estos grficos, se obtuvieron los valores de energas de activacin de (49 13) y (8.4 1.9) kJ mol-1 para los decaimientos de primer y segundo orden, respectivamente. El moderado efecto de la temperatura en kseg ya haba sido informado por George y Chovelon [George y Chovelon, 2002]. Ervens [Ervens, 1997] obtuvo una energa de activacin de (7 3) kJ mol-1 que concuerda con el valor encontrado.

21

20

ln k

6
0.0033 0.0034 0.0035

T-1 / K-1
Figura 4.2: Grficos de Arrhenius para kprim. () y kseg. (), obtenidas de los ajustes de los datos

con la Ecuacin 4.1 de las trazas de flash-fotlisis a 450 nm de soluciones de Na2S2O8 0.01 M. Para el estudio de la reactividad del radical SO4 con las distintas SH, se fotolizaron soluciones de Na2S2O8 1 10-2 M, en presencia de concentraciones crecientes de SH. Se ensayaron el cido hmico Aldrich (AHA) comercial y el AHA purificado, los cidos hmico y flvico de turba de Waskish de la IHSS (AH IHSS y AF IHSS) y el extracto de vermicompost (Ext. OH). Los experimentos de flash-fotlisis de soluciones de Na2S2O8 con 400 gL-1 de AHA se observ la formacin de un radical cuyo espectro de absorcin coincide con el publicado para el radical SO4( Figura 4.1) [McElroy y Waygood 1990]. Para evitar la produccin de otros radicales por la fotlisis de las SH, se coloc en la camisa externa de la celda de fotlisis una solucin de mayor concentracin de SH a modo de filtro, para que la luz que ingresa a la celda sea absorbida principalmente por el peroxidisulfato. 66

Las trazas obtenidas a 450 nm con soluciones de Na2S2O8 1 10-2 M en presencia de SH de diferentes orgenes en el intervalo de 0 a 400 g L1 fueron ajustadas a una cintica de orden mixto con la Ecuacin 4.1, con kap la constante de decaimiento del SO4 en lugar de kprim. El peso de la componente de segundo orden disminuye a medida que aumenta la concentracin de sustancias hmicas, y para concentraciones del orden de los 100 gL 1 los datos se pueden ajustar muy bien con una cintica de primer orden. Los decaimientos para el radical SO4 a 450 nm, obtenidos por flash-fotlisis convencional de soluciones acuosas 0.01 M de Na2S2O8 en presencia de 400 gL-1 de AHA o en ausencia del mismo y a 293.2 K, se muestran en la Figura 4.3.

0.08 0.06

0.04 0.02 0.00 0.0000 0.0005 0.0010 0.0015

t /s

Figura 4.3: Decaimiento a 450 nm con soluciones de Na2S2O8 0.01 M en ausencia de AHA (rojo)

o en presencia de 400 gL-1 de AHA (verde), a 293.2 K. Las lneas slidas corresponden a las simulaciones de los datos experimentales para las dos concentraciones de AHA. kap, aumenta con la concentracin de SH expresada en gL1, alcanzando un valor constante para altas concentraciones de sustancias hmicas. (Figuras 4.4, 4.5 y 4.6). Se han encontrado desviaciones a los comportamientos lineales tipo Stern-Volmer en experimentos con sustancias hmicas. Por ejemplo, Lang y col. observaron una curvatura descendente en el grfico de Stern-Volmer de la titulacin con Cu2+ de la fluorescencia de sustancias hmicas. Este comportamiento fue asignado a la presencia simultnea de quenching esttico y dinmico de los estados singletes excitados [Lang y col., 1997]. Hessler y col. estudiaron el quenching de la fosforescencia en estado estacionario del oxgeno singulete a 1270 nm por SH de diferentes orgenes. El grfico de Stern-Volmer del quenching muestra una fuerte desviacin debida a la interaccin entre el sensibilizador (Rosa de Bengala) y las SH [Hessler y col., 1996]. 67

3000

k ap / s

-1

2000

1000 0 100 200 300 400

CSH (g/L)
Figura 4.4: Grfico de kap contra la concentracin de sustancias hmicas, obtenido a partir de la

fotlisis de soluciones acuosas conteniendo 1 10-2 M Na2S2O8 a 293.2 K, y diferentes muestras de SH: AHA (), AHA purificado (), AH IHSS (), AF IHSS (), y Ext. OH (). Las lneas muestran el ajuste de los datos segn la Ecuacin 4.2. Se observa que la purificacin del AHA no modifica en forma cualitativa la dependencia de kap con la concentracin, slo varan los valores de las constantes observadas del ajuste (ver Tabla 4.2). Las constantes de velocidad obtenidas con el AHA purificado son mayores que las que se obtienen con el cido comercial. Esto puede deberse a la presencia de iones metlicos y material inorgnico presente en el AHA no purificado que contribuya a disminuir el tiempo de vida del radical sulfato. Las Figuras 4.5 y 4.6 muestran la dependencia de kap con la CSH en experimentos realizados con AHA y AF IHSS a diferentes temperaturas en el intervalo 283.2 a 303.2 K.

68

-4.0

ln c

6000

-4.5 -5.0

A
T-1/ K-1

kap/ s-1

4000

0.0033 0.0034 0.0035

2000

0 0 100 200 300

-1

400

CSH / g L

Figura 4.5: Grfico de kap contra la concentracin de AHA, obtenido a partir de la fotlisis de

soluciones acuosas conteniendo 1 10-2 M Na2S2O8, a diferentes temperaturas de trabajo: 283.2 K (), 288.2 K (), 293.2 K (), 298.2 K (), y 303.2 K (). Las lneas muestran el ajuste de los datos segn la Ecuacin 4.2. Recuadro: grfico de Vant Hoff de ln c contra T-1 para el AHA.

ln c

6000

-3.5 -4.0 -4.5 -5.0 -5.5

A
0.0033 0.0034 0.0035

kap/ s-1

4000

T /K

-1

-1

2000

0 0 100 200 300

-1

400

CSH / g L

Figura 4.6: Grfico de kap contra la concentracin de AF IHSS, obtenido a partir de la fotlisis de

soluciones acuosas conteniendo 1 10-2 M Na2S2O8, a diferentes temperaturas de trabajo: 289.2 K (), 293.2 K (), 297.2 K(), y 301.2 K (). Las lneas muestran el ajuste de los datos segn la Ecuacin 4.2. Recuadro: grfico de Vant Hoff de ln c contra T-1 para AF IHSS.

69

Los resultados se pueden interpretar con un mecanismo como el que se muestra en el Esquema 4.1. El mecanismo transcurre por la asociacin reversible del anin S2O82 a las SH. Se ha publicado para otros aniones como cromato, arseniato, arsenito, sulfato, silicato y fosfato, su capacidad de unirse a las SH [Sanjay y col., 1999; Sachs y col., 2004].

S2O8

2-

SH
(7)

S2O8 2- (SH) h (6) 2 SO4.- (SH)

SO4.(8)

SH
(10)

SO4.- (SH)
(9)

h (5) 2 SO4.SO4.-

SH (grupos reactivos)

(11)
Esquema 4.1

Radicales orgnicos

La interaccin del radical sulfato con las SH puede ser mediante abstraccin de H o transferencia de carga con los grupos reactivos presentes (reaccin 11), o por la particin con las SH (proceso reversible en el esquema, reaccin 10). El radical sulfato asociado, SO4(HS), puede interpretarse como el radical sulfato en un ambiente diferente al del seno de la solucin. Como se describi en el captulo anterior, el AHA forma en solucin acuosa pseudomicelas con dimetros de entre 1 y 10 micrones. El tamao y las caractersticas de las mismas son afectados por la presencia de peroxodisulfato en la solucin. Por otro lado, Myneni ha publicado la formacin de dominios globulares en soluciones de cidos hmicos y flvicos, de tamaos del orden de los 300 nm3 [Myneni, 2002]. La dependencia experimental de la constante aparente kap con la concentracin de las SH se puede ajustar bien con la Ecuacin 4.2 para las diferentes SH empleadas:
(a + b C SH ) (1 + c C SH )

k ap =

Ec. 4.2

Las reacciones 5 y 6 corresponden a la fotlisis del anin peroxodisulfato en solucin o unido a las SH para generar respectivamente al radical sulfato libre o asociado. Estos radicales se encuentran en equilibrio, segn la reaccin reversible 10. La constante de velocidad k8 corresponde 70

al conjunto de reacciones de pseudo primer orden responsables del decaimiento del radical SO4 en ausencia de SH, y coincide con kprim. El decaimiento de la concentracin molar total de los radicales intermediarios de reaccin, [I] = [SO4 ]+ [SO4( HA)], est dada por la Ecuacin 4.3.
d[I ] . 2 + k8 SO4. + k11 SO4. [ SH ] + k9 SO4. ( HS ) = k4 SO 4 dt

Ec. 4.3

Si los radicales sulfato libres y ligados se encuentran en equilibrio rpido, se puede expresar la concentracin total de intermediarios como [I] = [SO4( ]1+K10 [SH]), y entonces el decaimiento del radical sulfato est dado por la Ecuacin 4.4.
. . . . SO4 SO4 SO4 + k8 + ( k11 + k9 K10 ) [ SH ] d [ SO4 ] k4 = dt (1 + K10 [ SH ]) 2

Ec. 4.4

La Ecuacin 4.4 predice una cintica de decaimiento de orden mixto para el radical SO4, con una constante de velocidad de primer orden, kap, dependiente de la concentracin de SH como se muestra en la Ecuacin 4.5. ( k8 + ( k11 + k9 K10 ) CSH ) ( a + b CSH ) = (1 + K10 CSH ) (1 + c CSH )

kap =

Ec.4.5

Si la principal especie que absorbe a 450 nm es el radical SO4 libre, la Ecuacin 4.5 ajusta el valor de kap, de acuerdo a lo observado a partir del anlisis de los datos experimentales con la Ecuacin 4.2. Adems, el espectro de absorcin normalizado del radical sulfato obtenido en presencia de 400 g L-1 de AHA y el obtenido en ausencia de SH son coincidentes, como se observa en la Figura 4.1. La comparacin de las ecuaciones 4.2 y 4.5 nos muestra que el parmetro a coincide con la constante k8, el parmetro b con (k11 + k9 K10)/(106 PM), y que K10 = 106 c PM, donde PM es peso molecular nominal de la sustancia hmica. Los valores de las constantes para las distintas SH se listan en la Tabla 4.2.

71

Tabla 4.2: Valores de los parmetros del ajuste de la Ecuacin 4.2 a 293 K para las distintas SH.

Muestra AHA AHA purif AH IHSS AF IHSS Ext. OH

a / s-1 1100 100 1090 90 1000 200 1000 200 1000 100

b / g-1L s-1 40 10 50 10 70 40 50 20 24 10

c / g-1 L 0.013 0.005 0.012 0.002 0.03 0.01 0.02 0.01 0.010 0.005

c / mol(C)-1L (4 1) 105 (3.3 0.5) 105 (8 2) 105 (4 1) 105 (8 2) 105

El anlisis de los comportamientos obtenidos para el AHA y el AF IHSS a diferentes temperaturas en el intervalo estudiado, nos permite obtener la dependencia con la temperatura de los parmetros b y c. Del anlisis de los grficos de vant Hoff de ln c vs. T-1 (recuadros de las Figuras 4.5 y 4.6) se obtienen los valores de la diferencia de entalpa para la reaccin 10, H10 de -(37 11) kJ mol-1 para el AHA y de -(76 10) kJ mol-1 para el AF IHSS. No he encontrado en bibliografa datos termodinmicos para la asociacin de aniones a sustancias hmicas, que me permita discutir los resultados de H10. Tomando los valores publicados para el peso molecular nominal del AHA (4.7 103 g mol-1 [Oloughlin y col., 2000], 4.1 103 g mol-1 [Perminova y col., 2003]) se obtiene un valor de K10 del orden de (6 2) 107 a 298.2 K. A partir de estos valores, se calcula G10 = RT Ln K10 = -44.7 kJ mol-1, y por tanto TS10 = 7.7 kJ mol-1. Por lo tanto el binding del anin esta controlado por la exotermicidad de la interaccin con el AH, y el aumento entrpico podra deberse a la liberacin de molculas de agua de solvatacin. Para otras SH a 293 K se obtuvieron comportamientos similares para el ajuste de kap con la concentracin, tal como se observa en la Figura 4.4. Los valores obtenidos de los ajustes se muestran en la Tabla 4.2. Para estas muestras no pudo calcularse el valor de K10 por no conocerse el peso molecular. El extracto alcalino de vermicompost puede contener adems materia orgnica diferente a las sustancias hmicas. Se realizaron ensayos para cuantificar la asociacin del peroxodisulfato a las sustancias hmicas. Se prepararon soluciones de S2O82 1 10-2 M, AHA 400 g L-1 y S2O82 1 10-2 M con AHA 400 g L-1. Para separar el peroxodisulfato libre del asociado a las SH se ultracentrifugaron las soluciones durante 3hs a 60000 rpm y 10C, con un equipo Beckman Coulter Optima MAX en el grupo del Dr. Balatti (INFIVE, UNLP). Para determinar la concentracin de S2O82 en solucin se agreg al sobrenandante una alcuota de solucin patrn de sulfato ferroso amnico ([Fe+2] = 1 10-2 M) y el exceso de hierro (II) se titul con solucin recin valorada de KMnO4 [Vogel, 72

1947]. El peroxodisulfato asociado a las SH se calcul como la diferencia entre el total inicial y el libre en solucin luego de la centrifugacin. Se titularon alcuotas de las soluciones de AHA, de S2O82 y de AHA + S2O82 , antes y despus de la centrifugacin, y se midieron los espectros UV-visible de las 6 muestras. Las concentraciones de S2O82 obtenidas para las soluciones sin centrifugar son: 0 M para la solucin de AHA, (9.68 0.01) 10-3 M para la de S2O82 + AHA y (9.70 0.01) 10-3 M para la de S2O82. Para la solucin centrifugada de S2O82 + AHA la concentracin es de (9.53 0.02) 10-3 M. En presencia de AHA, la concentracin de peroxodisulfato asociado es 2% del valor de la concentracin inicial, lo que implica que la asociacin del S2O82 y el AHA (equilibrio 7), existe pero no es importante en el mecanismo de reaccin planteado. A partir de estos resultados, se obtiene un valor de K7 = 2.1 105 M-1, el cual es mucho menor a K10. Para probar el mecanismo propuesto en el esquema 1 se realizaron simulaciones de los ensayos realizados a 293 K con diferentes concentraciones de AHA en el mismo intervalo que el experimental. Se considera que la absorcin de la emisin de luz del flash por el S2O82 produce un delta de radicales SO4. El valor de la concentracin inicial del radical sulfato [SO4]o se estim a partir de la extrapolacin a tiempo cero del ajuste de la absorbancia medida en ausencia de SH, tomando el valor de 450 (SO4 =)1650 M-1cm-1 [McElroy y Waygood, 1990]. Los experimentos en ausencia de AHA se reprodujeron bien considerando la concentracin inicial del radical sulfato [SO4]o 5.510-6 M y, kprim = 1.4103 s-1, y kseg = 2108 M-1s-1. En la Figura 4.3 se observa la buena concordancia entre los decaimientos experimentales y los simulados. Para simular los ensayos en presencia de SH se usaron los mismos parmetros que para la simulacin del radical sulfato en ausencia de SH. Los valores de las constantes de velocidad del radical sulfato con las SH utilizados en las simulaciones que mejor ajustaron los resultados experimentales fueron k9 = 1 109 M-1 s-1 y k11 = 3 109 M-1 s-1, y el peso molecular del AHA 4.7 103 [Oloughlin y col., 2000]. Se consider a las reacciones 10 y -10 como reversibles, sin suponer la condicin de equilibrio. Para simular los perfiles de absorbancia a 450 nm se consider la contribucin de las dos especies de radical sulfato, libre y asociada., SO4 y SO4(HA). Asignndole al coeficiente de absorcin a 450 nm del radical SO4(HA) valores en el intervalo desde 0 a 1 104 M-1cm-1, la contribucin del mismo a la absorbancia es menor al 6% de la absorbancia total de la solucin. Esto concuerda con nuestra suposicin inicial de que la especie que absorbe principalmente a 450 nm es el radical sulfato libre. Se realizaron simulaciones con valores de k10 en el intervalo desde 1105 M-1 s-1 hasta el lmite difusional, 3 1010 M-1 s-1, pero manteniendo constante el valor de K10 = k10/k-10 = 5.9 107 M-1. Se observ que con valores de k10 menores a 1 109 M-1 s-1 no se poda simular los decaimientos experimentales, por lo que se tom 73

a ste como el lmite inferior en dicha constante. Con el valor determinado del contenido de carbono del AHA de 42% P/P y su peso molecular de literatura, se obtiene un valor de k10 > 6 106 L mol(C)-1s-1. Para todas las concentraciones de AHA, la relacin [SO4(AHA)]/[SO4[]AHA] calculada a partir de las simulaciones a tiempos entre los pocos microsegundos y el tiempo necesario para consumir la mitad del radical sulfato formado, ajusta el valor de la constante de equilibrio calculada con un error menor al 20%. Este resultado confirma la suposicin de equilibrio entre las dos especies de radical sulfato obtenida de la resolucin de los datos cinticos, tal como se plantea en el esquema 1. Los decaimientos obtenidos con la simulacin para diferentes concentraciones de AHA se ajustaron a una cintica de orden mixto con la Ecuacin 4.1. Los valores de kap obtenidos se graficaron contra la concentracin de AH, reproduciendo el comportamiento experimental como se puede ver en la Figura 4.8 Todos estos resultados estn de acuerdo con el mecanismo propuesto. No se encontraron en la literatura constantes de velocidad del radical sulfato con SH. Para reacciones del radical HO con molculas de gran tamao y con grupos aromticos, las constantes de velocidad publicadas varan en un intervalo de un orden de magnitud (107 - 108 L mol(C)-1 s-1) [Westerhoff y col., 1999]. Este radical reacciona con los sitios reactivos de molculas grandes con constantes de velocidad limitadas difusionalmente. Estas molculas se pliegan sobre s mismas bloqueando algunos sitios, por lo que las constantes de velocidad observadas son menores a las esperadas para el nmero de sitios reactivos presentes [Westerhoff y col., 1999]. El lmite inferior para la constante de velocidad k10 > 6 106 L mol(C)-1s-1 y las constantes publicadas para el radical HO con sustratos similares, estn de acuerdo con la reactividad de ambos radicales. Para observar el efecto de la fuerza inica (I) en la constante de equilibrio K10, se realizaron ensayos de flash-fotlisis con soluciones de peroxodisulfato 0.01 M y diferentes concentraciones de AHA a 20C, en presencia de concentraciones crecientes de distintos electrolitos. Para regular la fuerza inica de las soluciones se les agreg sales de cationes mono y divalentes. El pH de la solucin se ajust a 4.7, donde los grupos cidos del AHA estn parcialmente deprotonados, y a 3.0, donde estos grupos estn principalmente protonados [Andjelkovic y col., 2006].

74

-1.2 -1.4

log K10

-1.6 -1.8 -2.0 -2.2 0.24

0.25

0.26

0.27

0.28
1/2

0.29

0.30

0.31

Figura 4.7: grfico del log K10 vs. I1/2 para experimentos con AHA a 293.2 K con el agregado de

los electrolitos: Mg(ClO4)2 a pH = 4.6 (), NaClO4 a pH = 4.6 (), y Mg(ClO4)2 at pH = 3.0 (). Tambin se graficaron los ajustes lineales de los datos a pH 3.0 (en azul) y a pH 4.6 (en verde), este ltimo con su intervalo de confianza del 99%.

En la Figura 4.7 se muestra la dependencia del logaritmo de K10 con la raz cuadrada de I, con los distintos electrolitos ensayados. Los resultados obtenidos con Mg(ClO4)2 y NaClO4 se ajustan a la misma recta, lo que indica que el efecto observado se debe a la fuerza inica y no a la valencia del catin. A pH 4.6 se observa un aumento del log K10 con I1/2 debido a la interaccin de dos especies cargadas negativamente, el radical sulfato y el AHA deprotonado, mientras que a pH 3 no se observa un efecto de la fuerza inica. Este comportamiento es esperable para la asociacin de un anin con una especie sin carga, el AHA no disociado. Para poder predecir el comportamiento del radical sulfato en los mtodos de degradacin oxidativa in situ (ISCO), se estudi por flash-fotlisis un sistema similar al anterior (soluciones acuosas de peroxodisulfato 0.01 M y diferentes concentraciones de AHA en el intervalo de 0 a 400
gL1 siguiendo el decaimiento del radical sulfato a = 450 nm) con el agregado de 2 10-6 M de

fenol como contaminante modelo. Las seales se ajustaron nuevamente a un decaimiento mixto con la Ecuacin 4.1. Como se puede observar en el recuadro de la Figura 4.8, la presencia de fenol en la solucin disminuye la concentracin de radical SO4 generada, ya que este acta como filtro

75

interno y acelera el decaimiento de las trazas por reaccin con el radical SO4. Los valores de kap se graficaron en funcin de la concentracin de AHA, como se ve en la Figura 4.8.

8000
0.04

0.02 0.00 0.0003 0.0006 0.0009

6000

k ap /s

-1

t/s

4000

2000 0 100 200 300 400

CAHA / gL

-1

Figura 4.8: Grfico de kap contra la concentracin de AHA, CAHA, obtenido con 1 10-2 M S2O82

a 293.2 K en presencia de 210-6 M de fenol () y en ausencia de fenol (). Las cruces (en azul y marron, respectivamente) corresponden al valor de kap obtenida del ajuste de las trazas simuladas con la Ecuacin 4.1. Las lneas muestran el ajuste de los datos con la Ecuacin 4.2. Recuadro: Decaimiento obtenido a 450 nm con soluciones 0.01 M de S2O82 y 2 10-6 M de fenol en presencia de 400 gL-1 de AHA (traza inferior, en rosa) o en ausencia de AHA (traza superior, en azul) a 293.2 K. Las lneas corresponden a la simulacin de los datos experimentales. Dichos experimentos fueron simulados con el mismo conjunto de parmetros iniciales que se us para los experimentos en ausencia de fenol. Para la reaccin de SO4(HA) con fenol, se utiliz la constante de velocidad bimolecular determinada en ensayos en ausencia de sustancias hmicas, 2.2 109 M-1s-1 [Mrtire y Gonzalez, 2001]. Se observa tambin una buena concordancia entre los valores de kap obtenidos experimentalmente y los simulados (Figura 4.8), lo que indica que el fenol es capaz de reaccionar con velocidades similares con el radical sulfato libre y el unido a las SH, y con la misma eficiencia. En la Figura 4.9 se observan los perfiles de concentracin de fenol obtenidos de las simulaciones en ausencia de AHA (en verde) y en presencia de 400 gL-1 de AHA (en marrn). Como puede observarse, la degradacin del fenol es ms eficiente en ausencia de SH que en su presencia, debido a la competencia entre las SH y el fenol por los radicales SO4.

76

2e-6

2e-6

[Fenol]

1e-6

5e-7

0 0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010

t/s
Figura 4.9: Cintica de consumo de fenol por el radical SO4 en presencia de 400 gL-1 de AHA

(traza superior, en marrn) o en ausencia de AHA (traza inferior, en verde) de la simulacin de los datos experimentales.

Conclusiones:
Se plantea como parte del mecanismo de reaccin, una interaccin reversible entre el radical anin sulfato (SO4 )y las sustancias hmicas (SH). La desactivacin de los radicales SO4 mediante el mecanismo propuesto implica la competicin entre las sustancias hmicas y los contaminantes por los radicales oxidantes. Los primeros pasos en el mecanismo resultan en la generacin de radical asociado a las sustancias hmicas, SO4(SH), con un tiempo de vida o (SO4(SH)) menor al del radical libre, o (SO4 )como se observo en las simulaciones cinticas por computadora. Los experimentos con fenol como modelo de contaminante muestran que tanto el SO4 como el SO4(SH) reaccionan con el sustrato con constantes de velocidad similares. Los tiempos de vida en presencia de fenol de los radicales libres y asociados son (SO4 )y (SO4(SH)), respectivamente. A partir de las simulaciones cinticas, se observa que la fraccin de radicales SO4 que reaccionan con fenol es mayor a la correspondiente para el radical asociado SO4(SH). Lo que resulta en una reduccin de la eficiencia del tratamiento oxidativo en presencia de sustancias hmicas, por lo menos para el caso del fenol como contaminante. Esto se confirma por los perfiles de consumo de fenol por el radical SO4 en ausencia y en presencia de SH.

77

b.- Estudio de la reaccin de SO4 con cido glico como modelo de las sustancias hmicas.
Como ya se mencion, la naturaleza compleja de las SH dificulta la deteccin y caracterizacin de intermediarios o productos de reaccin para corroborar el mecanismo propuesto. Por lo que se realizaron estudios similares con el cido glico, que ha demostrado ser un buen modelo del comportamiento de las SH [Tipping, 2002; Stevenson, 1994; Giannakopoulos y col., 2005]. Se estudiaron las reacciones del radical SO4 en soluciones de cido glico a pH 3.1 y 5.6, donde las principales especies presentes son el cido glico (AG) y su base conjugada el anin galato (G) , respectivamente. Se sigui el decaimiento de dicho radical en funcin de la concentracin de cido glico agregado, por la tcnica de flash-fotlisis convencional. La fotlisis de soluciones de S2O82 , en presencia de bajas concentraciones de especies de glico muestra un espectro de absorcin a mayores a 350 nm, que coincide con el del radical sulfato obtenido en ausencia de sustrato orgnico, el que ya se mostr anteriormente. Las seales obtenidas a 450 nm pueden ajustarse bien con la ecuacin A = A0 exp(-kap t) + C (Recuadro de la Figura 4.10) y muestran un aumento de la velocidad de decaimiento con el incremento de la concentracin de sustrato orgnico (S). El valor muy pequeo de la constante C (menor al 1% del mximo de absorbancia) se asocia a la absorcin de especies de vida media larga, como por ejemplo los radicales orgnicos formados por la reaccin 12. De la pendiente de los grficos de kap, obtenida de promediar los resultados de cuatro experimentos independientes, contra la concentracin de substrato orgnico en experimentos a pH = 5.4 se obtiene la constante de velocidad bimolecular para la reaccin con el anin galato k12G-, que se lista en la Tabla 4.3. En la Figura 4.10 se muestran los resultados obtenidos a pH 3.1, donde la especie mayoritaria es el cido glico. SO4 + AG o G Radicales Orgnicos (12)

Debido a la pequea fraccin de galato presente a pH 3.1, el cual es ms reactivo con el radical SO4 que el cido glico, la constante de velocidad para el cido glico, k12AG, se calcul con la Ecuacin 4.6

AG G k12 = ( p k12 ) 10( pH pKa ) + p

Ec. 4.6

Donde p = (7.4 0.5) 108 M-1s-1 es la pendiente de la Figura 4.10, pKa = 4.4 y k12G- = (2.9 0.2) 109 M-1s-1.

78

2800

2600

k ap / s-1

0.04

2400

0.02 0.00

-0.02 0.000 0.001

2200 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

t/s

0.002

0.003

0.5

0.6

[S] / M
Figura 4.10: grfico de kap contra la concentracin de cido glico obtenidas por irradiacin de

soluciones de Na2S2O8 0.01 M a 293 K y pH = 3.1. Las barras de error se obtienen de la desviacin estndar de los resultados experimentales. La lnea slida azul muestra el ajuste lineal de los datos y las lneas de puntos azul oscuro representan el intervalo de confianza del 99%.
Recuadro: perfiles de absorbancia a 450 nm con soluciones de Na2S2O8 0.01 M con 0 (en rojo) y

610-7 M (en negro) de cido glico, a 293 K y pH = 3.1.

Tabla 4.3: constantes de velocidad bimoleculares de la reaccin del radical sulfato con especies

del glico. El error en k12G- se obtiene de la desviacin estndar del ajuste lineal entre kap y [G ;] el error en k12AG de la propagacin de errores de la Ecuacin 4.6 considerando los errores en p, k12G-, pH, y pKa son: 5 107 M-1s-1, 2 108 M-1s-1, 0.01, y 0.1 respectivamente.
k12G-/ M-1s-1 k12AG/ M-1s-1

(2.9 0.2) 109

(6.3 0.7) 108

Se estudiaron tambin los intermediarios de reaccin generados, para lo cual se obtuvieron los espectros de los radicales orgnicos por lser flash-fotlisis y de los productos por fotlisis convencional. En estos experimentos se utiliz una concentracin de especies de glico mayor que en los ensayos anteriores, para consumir totalmente el radical sulfato generado en tiempos cortos y poder observar solamente los decaimientos del radical orgnico. Los ensayos de lser flash-fotlisis se realizaron a pH 3.2 y 5.4, en soluciones de peroxodisulfato 5 10-2 M y 79

cido glico 10 M, mientras que los de fotlisis convencional se realizaron a los mismos valores de pH, con soluciones de S2O82 1 10-2 M y glico 5 M. Se observ en los experimentos de flash-fotlisis que la cintica de decaimiento de los radicales orgnicos se ajustaba a una ley de velocidad de segundo orden, y las constantes de recombinacin observadas son independientes de la concentracin de oxgeno disuelto, como se observa en la Tabla 4.4. Los experimentos de lser flash-fotlisis en ausencia de cido glico muestran la formacin de radicales SO4, los que decaen con una cintica de orden mixto. Del anlisis de los decaimientos a 450 nm y tomando el coeficiente de absorcin a esta longitud de onda del radical SO4 de 1650 M-1cm-1 [McElroy y Waygood, 1990], puede calcularse la concentracin inicial del radical SO4 = 5.3 10-6 M. A partir de los valores de las constantes de reaccin del radical SO4 con las especies de glico, el agua, los iones oxhidrilo y peroxodisulfato, y su constante de velocidad del proceso de recombinacin (ver Tablas 4.1 y 4.3), se determina que en estas condiciones experimentales todo el radical SO4 se consume antes de los 20 s despus del disparo del lser. Por lo que los decaimientos obtenidos en presencia de 50 M de cido glico que se muestran en el recuadro de la Figura 4.12, a tiempos mayores o iguales a 50 s despus del disparo del lser no muestran contribucin del radical sulfato. En las Figuras 4.11 y 4.12 se muestran los espectros de absorcin tomados a tiempos cortos, donde la contribucin del radical sulfato no puede despreciarse, y a 50 s despus del disparo a pH 3.1 y 5.4, respectivamente. Estos espectros se asignan por lo tanto a los radicales orgnicos generados por la reaccin 12.
Tabla 4.4: Constantes de velocidad de recombinacin de los radicales orgnicos obtenidos en

soluciones con diferentes concentraciones de oxgeno disuelto, para el cido glico y el anin galato. 2k / (cm s-1) Saturado en argn Saturado en aire Saturado en oxgeno Radical fenoxilo del AG ( = 310 nm) (2.0 1.0) 106
(a)

Radical fenoxilo del G ( = 320 nm) (1.5 1.0) 106

(a)

(3.2 1.2) 106 (a) (3.09 0.01) 106 (b)

(1.0 0.4) 106 (a) (2.45 0.02) 106 (b)

(2.6 1.0) 106 (a) (9.4 1.2) 105 (a) (a) Obtenido por fotlisis convencional; (b) obtenido en experimentos de lser flash-fotlisis.

80

0.020

Concentracin relativa

1.0 0.8 0.6

0.03

0.015
0.4 0.2 0.001 0.002 0.003 0.004

0.02

t/s

0.010

0.01

0.005

0.00 300 400 500 600

0.000

/ nm
Figura 4.11: Espectro de absorcin del radical orgnico generado por lser flash-fotlisis de

soluciones de Na2S2O8 5 x 10-2 M y cido glico 10 M tomado 5 () y 50 s () despus del disparo del lser, a pH = 3.2. Espectro de absorcin de los productos () generados por flashfotlisis convencional de soluciones de Na2S2O8 1 x 10-2 M y cido glico 5 M a pH = 3.2, obtenido del anlisis bilineal de los decaimientos experimentales. Recuadro: Perfiles de decaimiento del radical (en rojo) y formacin de producto (en azul) cuyos espectros se asignaron en la figura principal. En las condiciones en que se realizaron los experimentos de flash-fotlisis convencional, el radical SO4 se consume antes de 300 s y slo se detectan por los cambios de absorbancia los intermediarios orgnicos generados por la reaccin 12 y sus productos de reaccin. El anlisis de las trazas de los experimentos de flash-fotlisis convencional es complejo, debido a que tanto el radical orgnico como alguno de los productos de la reaccin absorben en el mismo intervalo de longitudes de onda. Para obtener los espectros individuales de las especies se realiz un anlisis bilineal de la matriz de datos experimentales. El perfil de absorbancia experimental a cada longitud de onda pudo reproducirse como una combinacin lineal de las absorbancias de cada especie. Tomando para el radical orgnico el espectro de absorcin de los experimentos de lser flashfotlisis, se obtiene el espectro de la segunda especie. El decaimiento del radical orgnico y la formacin de los productos obtenidos del anlisis de las trazas a pH = 3.1 se muestran en el 81

0.0

recuadro de la Figura 4.11. Debido a que la formacin del radical orgnico es muy rpida para ser detectada con el equipo de flash-fotlisis convencional, el espectro de la segunda especie se calcula como la diferencia entre la absorcin de los productos y los reactivos. Calculando la concentracin inicial del radical SO4 de experimentos en las mismas condiciones pero en ausencia de sustrato orgnico (3.9 10-6 M), y suponiendo la conversin total del SO4 en radicales orgnicos, pueden obtenerse los espectros de los productos. Estos se muestran en las Figuras 4.11 y 4.12 para los experimentos a pH = 3.1 y 5.4, respectivamente.

0.04

0.03 0.006 0.02 0.01 0.00 0 5e-5 0.004

0.03

0.02

t/s

1e-4

0.002

0.01

0.00 300 400 500 600

0.000

/ nm
Figura 4.12: Espectro de absorcin del radical orgnico generado por lser flash-fotlisis de

soluciones de Na2S2O8 5 x 10-2 M y cido glico 10 M tomado 2 () y 50 s () despus del disparo del lser, a pH = 5.4. Espectro de absorcin de los productos () generados por flashfotlisis convencional de soluciones de Na2S2O8 1 x 10-2 M y cido glico 5 M a pH = 5.4, obtenido del anlisis bilineal de los decaimientos experimentales. Recuadro: Decaimientos experimentales obtenidos por lser flash-fotlisis a longitudes de onda de anlisis de 320 nm (en negro) y 400 nm (en rojo).

82

Los espectros de absorcin de los radicales orgnicos formados por la reaccin del cido glico y el ion galato con el SO4( Figuras 4.11 y 4.12) son similares a los publicados para radicales tipo fenoxilo [Draper y col., 1989] y por lo tanto se asignaron a dichos radicales. En la Tabla 4.4 se observa que dichos radicales se recombinan por una ley de segundo orden y que su velocidad de recombinacin es independiente de la concentracin de oxgeno disuelto, lo que corrobora la asignacin realizada de los radicales orgnicos formados al tipo fenoxilo. Los valores de 2k / obtenidos por lser flash-fotlisis en ensayos con soluciones de Na2S2O8 5 10-2 M a pH = 5.4 son mayores a los obtenidos con soluciones 10-3 M de Na2S2O8 con flash-fotlisis convencional, como se espera para el efecto de la fuerza inica en la velocidad de reaccin de dos especies cargadas negativamente. Los valores de 2k / obtenidos por ambos mtodos a pH = 3.2 son independientes de la fuerza inica, como se predice para la reaccin de dos especies sin carga.

1.243 1.460 1.346 1.375 1.468 1.334 1.379

1.338 1.391 1.360 1.390 1.456 1.254 1.440 1.360 1.374 1.462

1.258 1.449 1.367 1.374

1.413

1.403 1.482

1.423

1.376 1.491 1.407 1.414 1.541 1.250 1.254

1.211

1.358

1.356

1.207

Figura 4.13: Geometras optimizadas de los radicales fenoxilo generados por la reaccin del cido glico o el anin galato con el radical anin SO4. Dwibedy y col. [Dwibedy y col., 1999] estudiaron la reaccin del cido glico con los radicales HO / O , N3 , y Br2 a diferentes valores de pH. Observaron la formacin del correspondiente radical fenoxilo con un pico a 310 nm un hombro en la regin de los 400 nm a pH 6.8, mientras que a pH mayor a 9.7 el pico se corre a 340 nm y el hombro se mantiene en la zona de 400 nm. El espectro de absorcin publicado [Jovanovic y col., 1995] para el radical fenoxilo del metil galato presenta un mximo a 310 nm a pH 3 con un hombro ancho en la zona de 340- 400 nm, mientras que el observado a pH 7 presenta picos a 340 y 420 nm, y a pH 10 el segundo pico se corre a 440 nm. Todo esto coincide con lo observado por nosotros a pH 3 y 5 para el radical fenoxilo del cido glico y el in galato, respectivamente, y valida la asignacin de especies realizada. Considerando que todo el radical SO4 generado en los ensayos de lser flash-fotlisis (5.3 10-6 M) reacciona con el sustrato orgnico, se calcula el valor del coeficiente de absorcin a 83

ambos valores de pH para el radical fenoxilo del cido glico a 310 nm y para el del ion galato a 320 nm de 8.1 103 M-1 cm-1 y 4.8 103 M-1 cm-1, respectivamente. Con estos valores del coeficiente de absorcin se obtienen los valores de las constantes de velocidad de segundo orden 2k = 2.5 1010 M-1 s-1 a pH 3.1. La constante de velocidad para el ion galato depende de la fuerza inica, como ya se mencion. Los valores de 2k son 4.8 109 M-1 s-1 a I = 0.03 M (en ensayos de flash-fotlisis convencional), y 1.2 1010 M-1 s-1 a I = 0.15 M (en ensayos de lser flash-fotlisis), a pH = 5.4. Estos valores de constantes de velocidad, cercanos a las controladas difusionalmente, coinciden con los publicados para radicales fenoxilo no sustituidos [Merga y col, 1994]. Para confirmar la formacin de los radicales fenoxilo de las distintas especies del cido glico, y para investigar el mecanismo de formacin de estas especies, se hicieron clculos por la teora del funcional de la densidad. La formacin de los radicales fenoxilo es el primer producto de la reaccin 12, y puede llevarse a cabo por alguna de las siguientes vas de reaccin: a) Transferencia electrnica desde el cido glico al radical anin sulfato formndose el radical catin del cido glico y el anin sulfato (Reacciones C e I de Tablas 4.5 y 4.6). El radical catin contina reaccionando por una hidratacin rpida y reversible para dar el radical hidroxiciclohexadienilo (HCHD) [Draper y col., 1989]. La eliminacin del agua de radicales HCHD de fenoles genera radicales fenoxilo, como fue publicado por Merga y por Adams [Merga y col., 1994; Adams y col., 1966]. b) La va de adicin y eliminacin que genera un aducto del radical sulfato, seguida de la eliminacin del anin sulfato, y dando adems radicales HCHD [Mrtire y Gonzalez, 2001]. c) La abstraccin de hidrgeno del fenol por el radical anin sulfato (Reacciones A, B y H de Tablas 4.5 y 4.6) [Leopoldini y col., 2004]. Los resultados se listan en las Tablas 4.5 y 4.6. Los clculos realizados para las reacciones A y B de la Tabla 4.5 y para la H de la Tabla 4.6 muestran que los procesos de abstraccin de hidrgeno de los grupos OH son exotrmicos. La transferencia de carga de un electrn desde el cido glico o el in galato hacia el radical sulfato para generar los correspondientes radicales cationes (reacciones C e I) son endotrmicos, como tambin la eliminacin del protn para formar el radical fenoxilo a partir del radical catin (reacciones D y J). Los intentos de calcular la adicin directa del radical sulfato a los anillos aromticos no pudieron realizarse. Al acercarse el radical a los grupos fenlicos del cido glico o del galato se favorece la reaccin de transferencia de carga lo que indica que no es posible la ruta de adicin/eliminacin.

84

Por lo tanto, los resultados muestran que la reaccin tiene lugar por va de la abstraccin de hidrgeno. Resultados similares se observaron para el caso de compuestos aromticos con dos grupos OH en posicin orto [Leopoldini y col., 2004]. Como los resultados experimentales muestran una recombinacin de segundo orden de los radicales fenoxilo tanto a pH 3.1 como a 5.3 (Tabla 4.4), se calcularon las energas Eo para las diferentes reacciones de recombinacin de acuerdo a los posibles productos predichos por Fang [Fang y col., 2000] para otros radicales fenoxilo con sustituyentes halogenados. Tanto las reacciones E y K que generan bifenilos, como las disproporcionaciones para dar quinonas (F, G, L y M) resultaron ser exotrmicas. Las estructuras optimizadas de los bifenilos se muestran en la en Figura 4.14. La recombinacin de los fenoxilos por el tomo de oxgeno para dar los correspondientes perxidos orgnicos no es significativa debido a la baja energa del enlace O-O [Fang y col, 2000], lo que predice una reaccin reversible. Los clculos tericos de molculas con enlaces O-O no pudieron realizarse, ya que estos tendan a la ruptura de dicho enlace durante la optimizacin de la geometra molecular. Para confirmar los resultados experimentales y los clculos tericos realizados sobre los posibles productos de la reaccin 12, se analizaron los productos por el test NBT/glicinato para quinonas y HPLC/MS. El test para quinonas dio resultados positivos para los productos de la reaccin del radical sulfato con cido glico y con galato. El anlisis por HPLC/MS se realiz para la reaccin del galato nicamente (pH 5.4), y se obtuvieron dos picos. Uno de ellos presenta un tiempo de retencin de 2.74 min corresponde por su peso molecular y su espectro de absorcin al peroxodisulfato. El otro pico tiene un tiempo de retencin de 3.46 min, y se asign por su peso molecular a la quinona que se obtiene como producto de la reaccin M de la Tabla 4.6. El espectro de absorcin de esta quinona es similar al observado para otras quinonas [Gibaja Oviedo, 1998; Faig y col., 1958]. Esta reaccin de recombinacin de radicales fenoxilo a ese pH es la ms favorable termodinmicamente segn los clculos realizados.

85

1.97

1.37 1.27

1.48

1.477

0.97

1.20 1.35

1.35 1.04 1.48

1.51

Figura 4.14: geometras optimizadas B3LYP/6-311++G** de los bifenilos productos de las

reacciones E y K, respectivamente. Las distancias estn expresadas en .

Conclusiones:
Los resultados experimentales y los clculos mediante la teora del funcional de la densidad (DFT) confirman el mecanismo propuesto. En este mecanismo se postula la formacin de radicales fenoxilo como intermediarios de reaccin de la oxidacin del cido glico y el galato por el radical anin sulfato. Los clculos tericos apoyan la formacin de quinonas y bifenilos sustituidos por recombinacin de los radicales orgnicos. Como se observa de los resultados experimentales, no se puede extrapolar la reactividad del radical sulfato con cido glico a la de ste radical con las sustancias hmicas. En los experimentos a pH 5.4 se detect la quinona correspondiente a la reaccin M como nico producto de reaccin y esta sustancia result ser el producto ms favorable termodinmicamente segn los clculos tericos.

86

Tabla 4.5: valores de energa Eo, Ho y Go (todos en kcal/mol-1) obtenidos de los clculos

tericos en fase gaseosa y de Eo en solucin, para las reacciones que involucran al cido glico o su radical fenoxilo (298.15 K). Reacciones
OH HO OH

Eo (g)
.
O

Eo (sol)

Ho (g)

Go (g)

+
COOH
OH HO OH

SO4.-

HO

OH

+
COOH
OH HO O.

HSO4-

-18.50 (A)

-27.21

-12.62

-18.72

+
COOH

SO4.COOH

HSO4-

-17.87 (B)

-23.16

-17.94

-18.11

OH HO OH

OH

+
COOH
OH HO + COOH OH

SO4.-

HO +

OH

SO4-

223.76 (C)

137.88

223.39

223.83

COOH

.
O HO OH H+

+
COOH

202.73 (D)

253.97

202.45

203.02

.
O HO 2 COOH OH HO HO OH COOH
OH OH HO OH

HOOC HO

OH OH

-27.57 (E)

-24.28

-27.09

-13.19

.
O HO 2 COOH OH HO O

H2O

+
O
O

+
COOH

HCOOH

-2.94 (F)

-4.05

-3.40

-4.27

.
O HO 2 COOH OH HO

OH O HO OH

+
COOH COOH

-3.31 (G)

-4.73

-2.66

-3.31

87

Tabla 4.6: valores de energa Eo, Ho y Go (todos en kcal/mol-1) obtenidos de los clculos

tericos en fase gaseosa y de Eo en solucin, para las reacciones que involucran al anin galato o su radical fenoxilo (298.15 K). Reacciones
OH HO OH HO

Eo (g)
.
O OH

Eo (sol)

Ho (g)

Go (g)

+
COO-

SO4.COO -

HSO4-

-29.10 (H)

-30.88

-29.33

-29.32

OH HO OH HO

OH OH + COO

+
COOOH HO + COO OH

SO4.-

+
-

SO4-

115.70 (I)

141.60

115.43

115.65

.
O HO OH

+
COO-

H+

300.19 (J)

246.57

299.70

300.60

.
O HO 2 COO OH HO HO

- OOC

HO

OH OH

26.01 (K)

25.63

41.87

OH COO-

.
O HO 2 COO OH HO O OH HO OH OH

HO
2

+
O COO-

HCOO-

16.77 (L)

5.72

16.29

15.92

.
O HO 2 COO OH HO

O O HO

OH OH

+
COOH COO-

0.98 (M)

-4.30

1.64

5.02

OH HO + COO OH

OH HO OH

CO

0.17 (N)

82.43

0.71

-9.79

88

Radicales Cl y Cl2

Cuando se irradian soluciones de S2O82 110-3 M en presencia de NaCl en concentraciones mayores a 1 10- M, no se observa la seal a 450 nm caracterstica del radical SO4, por la alta eficiencia de la reaccin entre este radical y los iones cloruro (Reaccin 13). Esta reaccin posee una constante de velocidad de 4.7 108 M-1s-1 en soluciones con fuerza inica I=0.1M [Ross y col., 1998]. Los tomos de cloro reaccionan reversiblemente con los iones cloruro para dar el ion radical Cl2, reacciones 13 y 14 con constantes de velocidad 8.5 109 M-1 s-1 y 6.0104 s-1 [Ross y col., 1998]. Ambas especies, Cl y Cl2 absorben por debajo de 380 nm con coeficientes de absorcin molar a 340 nm, 340 = 3800 M-1cm-1 [Yu y col, 2004] y 9600 500 M1

cm-1 [Nagarajan y Fessenden, 1985], respectivamente. Experimentos resueltos en el tiempo con soluciones de NaCl entre 0.1 M y 5 10- M, y
4

S2O82 5 10-3 M muestran la formacin de especies transientes con un mximo de absorcin a 340 nm, cuyo espectro concuerda con el publicado para el radical Cl2[ Adams y col, 1995], como se muestra en la Figura 4.15. La constante de equilibrio para las reacciones reversibles 14 y 15
K14,15 a 293 K se calcul a partir de los valores a 295 K (6.5 104 M-1 [Bao y Barker, 1997]) y a

298 K (1.4 105 M-1 , [Buxton y col., 1998]), obtenindose un valor de 3.9 104 M-1. Para el intervalo de concentraciones de ion cloruro utilizado en estos experimentos y con el valor de la constante de equilibrio ya calculado, la contribucin de los tomos de cloro en la absorcin de la solucin puede despreciarse, ya que en las condiciones experimentales utilizadas se mantiene la relacin (Cl2[)Cl2 ]/ (Cl)[Cl] > 100. El decaimiento de los transientes generados sigue una cintica compleja, que depende de la concentracin de cloruros, [Cl]. Las trazas del radical Cl2 pueden ajustarse a una cintica mixta de primero y segundo orden, cuya ley de velocidad se esta dada por la Ecuacin 4.1, como se muestra en la Figura 4.17. La contribucin del comportamiento de segundo orden es ms importante en soluciones de Cl 10-1 M, y a medida que disminuye la concentracin de cloruros aumenta el peso del decaimiento de primer orden.

89

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00 300 320 340 360 380

/ nm
Figura 4.15: espectro de absorcin tomado 385 s despus del flash con soluciones acuosas de

S2O82 510-3 M y 9.610-4 M Cl con: 0 () y 6.4 mg L-1 () AHA a 293 K. La constante de velocidad de segundo orden k16 depende de la concentracin de cloruros, como se espera para el efecto de la fuerza inica en la reaccin de dos especies cargadas negativamente como son los radicales Cl2[ Alegre y col., 2000]. De la ordenada al origen del grfico lineal del log k16 contra I1/2/(1+ I1/2), de la Figura 4.16, se obtiene el valor de dicha constante de velocidad a fuerza inica cero a 293 K, k16o = 6.1 108 M-1 s-1, que es menor al publicado para esta reaccin a 298 K [Huie y Clifton, 1990; Huie, 1995; Alegre y col., 2000].

9.1

log k16

9.0

8.9

8.8 0.16

0.18

0.20
1/2

0.22

0.24
1/2

0.26

0.28

I /(1+ I )
Figura 4.16: log k16 contra I1/2/( I1/2+1) obtenido a partir de los datos a 293 K. 90

Las principales reacciones que tienen lugar en el decaimiento del radical Cl2 son: las reacciones reversibles 14 y 15, la recombinacin de Cl2, reaccin 16, y el conjunto de reacciones de los radicales Cl / Cl2 con el solvente y los iones oxhidrilo [Alegre y col., 2000], reacciones 17 a 21, que se listan en la Tabla 4.7. De acuerdo a este mecanismo, las reacciones de Cl y Cl2 con agua generan cloruros y radicales HO. Los radicales HO generados pueden afectar los equilibrios planteados por las ecuaciones 17 a 21, y la constante de velocidad de primer orden depender entonces de la velocidad de estas reacciones. Cuando todos los radicales HO generados se consumen, en nuestro sistema por recombinacin o por reaccin con S2O82 o SO42[ Alegre y col., 2000], ya no se establece el equilibrio. En este caso las cinticas de los radicales Cl y Cl2 con agua son de primer orden, como ya fue observado por Buxton [Buxton y col., 1998]. Tabla 4.7: principales reacciones que intervienen en el decaimiento del radical Cl2. SO4 Cl Cl2 Cl2 Cl Cl2 Cl Cl2 ClOH Cl Cl2 + + + +

Cl Cl Cl

Cl Cl2 Cl Cl2 ClOH ClOH ClOH ClOH + Cl

SO42

(13) (14) (15)

+ + + + +

Cl2 H2O H2O HO HO

+
+ +

2 Cl H+ H+ + Cl

(16) (17) (18) (19)

HO

Cl

(20) (21) (22) (23)

HA HA

Productos Productos

Para confirmar este mecanismo se realizaron simulaciones de los perfiles de absorbancia a 340 nm obtenidos. Se consideraron las reacciones 13 a 21, y las reacciones del radical SO4 con agua, HO y S2O82 , y la recombinacin de los radicales SO4. La concentracin inicial de SO4 se estim de ensayos en idnticas condiciones en ausencia de iones cloruro y con el 450 del radical SO4, como ya se ha mencionado. Las concentraciones obtenidas con las simulaciones de los radicales Cl y Cl2 se convirtieron a absorbancia con los correspondientes 340, y se compararon 91

los perfiles de decaimiento simulados con los experimentales, observndose una buena concordancia entre ellos. Cuando se realizaron experimentos de flash-fotlisis con soluciones acuosas de peroxodisulfato en presencia de iones cloruro en el intervalo 9.6 10 4 a 6.9 10 3 M y AHA en concentraciones menores a 8 10 3 g L1, se observ la generacin de especies transientes cuyo
-

espectro de absorcin presenta un mximo a 335 nm. El espectro observado en estas condiciones coincide con el obtenido para el radical Cl2 en experimentos realizados en las mismas condiciones en ausencia de AHA, como se observa en la Figura 4.15 y es asignado a dicho radical. Para una dada concentracin de iones Cl, se observa que la velocidad de decaimiento del radical Cl2 aumenta con la concentracin de AHA (Figura 4.17), de acuerdo a las reacciones 22 y 23 entre de radicales Cl y Cl2 con el AHA, respectivamente. Las seales de decaimiento experimentales se ajustaron con la Ecuacin 4.1, con una constante de primer orden kprim que depende linealmente con la concentracin de AHA, como se observa en la Figura 4.18. La absorcin remanente de la solucin asociada al trmino d() puede asignarse a especies de vida media ms larga, formadas a partir del decaimiento del radical Cl2. En las condiciones experimentales utilizadas, las principales reacciones que involucran al radical Cl2, al que se asume en equilibrio con el radical Cl, son aquellos listados en la Tabla 4.7. Para todas las soluciones se cumple la condicin K14,15 [Cl > ]1, por lo que se puede expresar la dependencia observada de kprim con [HA] mediante la Ecuacin 4.7.
k22 k prim = f ([Cl ]) + k23 + [ HA] K14,15 [Cl ]

Ec. 4.7

El trmino f([Cl )] incluye al producto k18[H2O], el que es menor a 100 s-1 [Yu y col., 2004], ms un trmino dependiente de la concentracin de cloruros que proviene de la reaccin reversible 17. Si consideramos slo la reaccin 17 de ida, f([Cl )] se puede aproximar a k18 + k17 /(K14,15 [Cl)] . Esta suposicin predice una disminucin de f([Cl )] con la concentracin de cloruros.

92

0.3

A340nm

0.2

0.1

0.0 0.0000 0.0005 0.0010 0.0015

t/s
Figura 4.17: decaimientos a 340 nm obtenidos con soluciones 5 10-3 M S2O82 y 1.7 10-3 M

Cl en presencia de (de arriba hacia abajo): 0 (rojo); 1.6 (azul); y 2.4 (verde) mgL-1 AHA, a 293 K. Las lneas slidas muestran el ajuste de los datos con la Ecuacin 4.1. Los grficos de kprim contra la concentracin molar de AHA, calculada asumiendo su peso molecular de 4.7 103 g mol-1 se comportan linealmente (Figura 4.18). Las ordenadas al origen de estos grficos, f([Cl )] de la Ecuacin 4.7, disminuyen al aumentar la concentracin de Cl , como se predijo. El grfico lineal de las pendientes de la Figura 4.18, P, contra la inversa de la concentracin de cloruros, [Cl] -1se muestra en el recuadro interno de la Figura 4.18. De este grfico se obtienen los valores de k23 = (1.15 0.15) 109 M-1s-1, y k22/K14,15= (8.0 0.8) 105 s-1 de la ordenada al origen y la pendiente de este grfico, respectivamente. Con el valor de K14,15 = 3.9 104 M-1 se obtiene un valor de k22 = 3.1 1010 M-1 s-1, en el lmite difusional. Se han publicado valores cercanos a los controlados difusionalmente para reacciones del tomo de cloro con sustratos aromticos [Alegre y col., 2000; Mrtire y col., 2001]. El valor de k22 igual a 3 108 en L mol(C)-1s-1 concuerda con valores publicados para el radical HO con molculas de gran tamao [Westerhoff y col, 1999].

93

P / s-1M-1

6000

2x109 2x109 1x109 0

-1

kprim / s

4000

[Cl-]-1/ M-1

500

1000

2000

0 0.00 0.50 1.00 1.50

[AHA]/ M
Figura 4.18: Dependencia de la constante de velocidad de primer orden del radical Cl2, kprim, con

[HA] para soluciones 5 10-3 M S2O82 y diferentes concentraciones de cloruro: 9.6 10-4 M (); 1.7 10-3 M (); 2.5 10-3 M (); 6.8 10-3 M (). Recuadro: Dependencia de la pendiente P del grfico principal con la inversa de la concentracin de cloruro, [Cl] -1. Las constantes de velocidad publicadas para el radical Cl2 con sustratos aromticos son menores a 106 M-1s-1 [Herrmann, 2003; Alegre y col., 2000; Mrtire y col., 2001], excepto para hidrocarburos aromticos con sustituyentes ricos en electrones. Sin embargo, se ha medido aqu una constante de velocidad mucho mayor para Cl2 con el AHA. Los radicales Cl2 reaccionan principalmente por oxidacin, con un potencial de E(Cl2/ 2Cl = )2.09 V contra el Electrodo Normal de Hidrgeno [Schwarz y Dodson, 1984]. Algunos compuestos orgnicos insaturados que contienen grupos carboxilato unidos al anillo aromtico (por ejemplo 4-aminobenzoato, metoxifenol, metoxibenzoato, aminobenzoato, y fenoxilbenzoato) reaccionan con el radical Cl2 con constantes de velocidad del orden de 109 M-1s-1 [Ross y col., 1998]. Los cidos humicos contienen grupos carboxilicos principalmente aromticos, dbilmente cidos (pK entre 4 y 5), y entre un 2.5 y un 3 % de N del cual 3-19 % corresponde a N aromtico, por ejemplo derivados de piridina, imina, o anilina [Suton y Sposito, 2005]. Al pH en que se realizaron los experimentos (aproximadamente 4), el cido hmico presenta un contenido significativo de carboxilatos, lo que justifica el alto valor de k23 observado.

94

Conclusiones:
La desactivacin del radical anin sulfato por iones cloruro disminuyen el tiempo de vida del radical sulfato, haciendo menos eficiente el tratamiento de contaminantes. Los radicales Cl/Cl2 son muy reactivos tanto con los contaminantes como con las sustancias hmicas presentes durante los tratamientos oxidativos, generando como productos compuestos clorados [Alegre et al. 2000, Malcolm & MacCarthy 1986], los que son generalmente ms txicos que los propios contaminantes. Se observa adems que los radicales de cloro no muestran el mismo comportamiento que el radical sulfato con la concentracin de sustancias hmicas. Para concentraciones de cloruros bajas, el equilibrio entre estos radicales (reacciones 14 y 15) est ms desplazado hacia el radical Cl, cuyo tiempo de vida es muy corto. Lo cual indica que su camino libre medio es muy corto como para posibilitar un proceso reversible entre dos entornos diferentes. Para concentraciones de cloruros altas, el equilibrio se desplaza hacia Cl2, cuya principal va de decaimiento es la recombinacin (reaccin 16), no pudiendo competir otros procesos como la compartimentalizacin en dos entornos qumicos distintos. Por estas razones, la existencia de un proceso de equilibrio de los radicales Cl/Cl2 asociados a las sustancias hmicas, anlogo al de la reaccin 10 para el radical anin sulfato no resulta favorable.

95

Captulo V. Degradacin fotoinducida de contaminantes.

a.- Clomazone.
Para modelar la fotodegradacin natural del clomazone, se utilizaron como fotosensibilizadores extracto alcalino de vermicompost (Ext. OH) y cido hmico Aldrich (AHA). Tambin se estudi la degradacin del herbicida por el radical sulfato como modelo de los mtodos oxidativos para degradacin de contaminantes in situ.

Estudio del mecanismo de reaccin con el radical anin sulfato. Para estudiar la reaccin del clomazone con el radical SO4, reaccin 1, se realizaron experimentos resueltos en el tiempo y de fotlisis estacionaria.
Cl O H3C H3C N O CH2 + SO4.Productos

(1)

Para la determinacin de la constante de velocidad del radical sulfato con clomazone se realizaron ensayos de flash-fotlisis convencional con soluciones de peroxodisulfato 1 10-2 M y bajas concentraciones de clomazone (en el intervalo 1 - 7 M), a pH = 4.4. Los resultados experimentales pudieron ajustarse a un decaimiento de primer orden, A = A0 exp (-kapp t) + C. El trmino constante C, menor al 2 % del mximo de absorbancia en todos los ensayos, est asociado a la absorcin de los radicales orgnicos generados por la reaccin. Las trazas obtenidas a diferentes longitudes de onda muestran un espectro de absorcin inmediatamente despus del flash de luz que coincide con el publicado para el radical sulfato. La dependencia de las constantes de reaccin aparentes con la concentracin de clomazone se muestra en la Figura 5.1. De la pendiente del ajuste lineal se obtuvo el valor de la constante de reaccin bimolecular k1 = (9.4 0.4) 108 M-1 seg-1.

96

Este valor es del orden de los publicados para el radical SO4 con diferentes clorobencenos (2-clorotolueno = 1.7 109 M-1 seg-1, 1,2-diclorobenceno = 6 108 M-1 seg-1 [Ross y col., 1998]). El anillo de isoxasolidona reacciona con el radical OH con una constante del orden de 9 109 M-1 seg-1 [Ross y col., 1998], mayor a la obtenida para el mismo radical con los mismos clorobencenos. Como se mencion en el captulo anterior, si bien el radical OH es menos selectivo y reacciona con cualquier sustrato con constantes de velocidad mayores o iguales a las del radical sulfato [Rosso, 2002; Neta y col., 1988], la diferencia de reactividad entre ambos radicales tpicamente no es mayor a un orden de magnitud. Por lo que no puede descartarse el ataque del radical sulfato al heterociclo.

8000

6000

k ap / s-1

0.06 0.04

Abs

4000

0.02 0.00 -0.02

2000

-0.04 0.0

t / seg

2.5e-4

5.0e-4

[Clomazone] / M
Figura 5.1: Dependencia de la constante de velocidad de pseudo primer orden (kap) con la concentracin molar de clomazone. Recuadro: decaimientos del radical sulfato y sus ajustes en ensayos con [S2O82-] = 1 10-2 M, en ausencia (rojo) y en presencia de 6 M de clomazone (azul), a 22C. Se realizaron experimentos de fotlisis continua con luz de exc > 200 nm, con soluciones acuosas de clomazone 7.6 10-4 M con o sin peroxodisulfato. Se sigui la degradacin del herbicida por HPLC y la disminucin del carbono orgnico total (TOC), en funcin del tiempo de irradiacin. Los resultados muestran que luego de 20 minutos de irradiacin con luz exc > 200 nm en presencia de 0.1 M de S2O82-, se degrada ms del 90 % del clomazone inicial (Figura 5.2), y a los 90 minutos de tratamiento se degrada casi totalmente el herbicida. En ausencia de S2O82- la 97

velocidad de degradacin es menor, ver Figura 5.2. Los valores de TOC muestran diferencia ms marcadas entre los experimentos en presencia y en ausencia de S2O82-. En los ensayos en presencia de S2O82- el TOC disminuye a valores por debajo del 5 % del inicial luego de 60 minutos. Mientras que en ausencia de S2O82-, el TOC se reduce slo un 25 % en tiempos de tratamiento de ms de 80 minutos.

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 20 TOC / TOC0

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 20 40 60 80

C / C0

Tiempo / min

40

60

80

Tiempo / min
Figura 5.2: Evolucin temporal de la concentracin relativa de Clomazone en soluciones del herbicida irradiadas en ausencia () o presencia () de Na2S2O8 0.1 M. Recuadro: Evolucin temporal de la medida de TOC relativa a la inicial en las mismas soluciones. Los productos de oxidacin detectados y caracterizados por sus espectros de masas se listan en la Tabla 5.1. Se observa que los productos A - E conservan el anillo aromtico, con oxidacin del carbono en posicin o ruptura del heterociclo en diferentes posiciones. Los productos A, B y C se generan por oxidacin del C al anillo aromtico, los que sugieren la participacin de radicales bencilo sustituidos como intermediarios de la reaccin de la siguiente forma:
Cl O H3C H3C N O CH2

+ SO4.-

CH

Cl

+ HSO4-

Donde R puede ser el anillo de isoxasolidona sustituido o alguno de sus productos de oxidacin (como se mencion anteriormente). 98

La formacin de estos radicales puede deberse a diferentes procesos, como por ejemplo la abstraccin de H del C al anillo por el radical sulfato, u otros mecanismos que involucran al radical hidroxiciclohexadienilo (HCHD) o al radical catin [Merga y col., 1994; Rosso y col., 2003; Mrtire y Gonzalez, 2001]. Las reacciones que intervienen en la formacin de los productos A y B se muestran en el Esquema 1. Los radicales bencilo reaccionan eficientemente con el oxgeno molecular para dar radicales peroxilo (reaccin 2) [Rosso y col., 2003], los que pueden desproporcionarse para generar compuestos carbonlicos y alcoholes (reaccin 3). El producto C corresponde a la oxidacin de los productos anteriores.
Cl + O2 R OO

CH

Cl x2 RCHOH

Cl +

CH

O R

Cl C

(2)

(3)
1

2 Cl

OO R

Cl x2 R

Cl O C

CH

CH

(4)
+ O2

(5)

R1

Esquema 1: Formacin de los productos de reaccin A y B a partir del radical bencilo sustituido. Los productos A y B corresponden respectivamente a los compuestos 1 y 2 con R = H. Los radicales peroxilo tambin pueden recombinarse para generar radicales alcxido y oxgeno molecular [Janik y col., 2000], reaccin 4. Los radicales alcxido reaccionan fragmentndose en un radical ms pequeo y clorobenzaldehido, reaccin 5. Para el radical bencilo del clomazone, R corresponde al anillo de 4,4-dimetil-3-isoxazolidona y R1 al radical:
CH3 O N
C

C CH3

CH2

Este radical reacciona por oxidacin posterior para dar el producto F.

99

Tabla 5.1: Productos por CG-MS de la degradacin del clomazone, generados por fotlisis de soluciones con 1 mM Na2S2O8. T es el tiempo en el cual se detecta el mximo de concentracin de dicho producto, TR es el tiempo de retencin en la columna. Producto
Cl CH2 HO

T (min) 5-10 A
Cl

TR (min) Espectro de masas (m/z) 77.1, 79.1, 107.1, 51.0, 85.0, 142.1, 50.0, 75.1, 73.0, 53.0, 63.1, 105.1, 78.0, 74.0, 4.22 62.0, 113.1, 139.0, 125.1, 144.1, 89.1, 80.1, 110.9, 76.1 139.1, 140.0, 110.9, 75.0, 50.0, 51.0, 141.0, 76.9, 142.0, 76.0, 206.9, 112.9, 74.1, 52.0, 119.8, 116.8, 112.1, 60.8, 69.3, 114.0, 71.9, 77.6, 73.1, 63.1 139.2, 85.0, 75.0, 111.2, 50.1, 83.0, 155.1, 141.2, 113.1, 157.1, 51.1, 77.2, 74.3, 73.1, 137.2, 55.2, 87.0, 76.1, 58.9, 65.1, 71.3, 208.3, 140.1, 280.9, 60.2, 63.3, 102.2, 110.2, 81.2, 133.3, 79.1 83.0, 116.9, 166.8, 164.9, 121.1, 129.9, 86.0, 132.1, 60.0, 168.8, 119.0, 95.1

CH O

10-15 B

3.70

OH Cl C O

30-45 C
Cl

5.66

CH2

10-45 D
Cl HO

2.89

83.0, 83.9, 51.1, 106.2, 105.1, 118.0, 77.1, 52.0, 50.1, 78.2, 119.9, 55.0 45-60 E 2.81 149.2, 57.2, 150.2, 56.2, 104.2, 76.1, 55.2, 50.2, 82.2, 65.2

OH

CH3

C OH

CH2OH

5-10 F

7.91

CH3

OH CH O

82.9, 85.0, 117.0, 83.9, 119.0, 60.1, 121.0, 86.9, 95.0, 70.1, 50.0, 96.1, 120.0 30-60 G 3.28

La reactividad de los anillos heterocclicos con radical sulfato (ver ms arriba) predice la formacin del producto D, que resulta de la ruptura del ciclo en el enlace N-O y en el enlace entre el carbono del grupo carbonilo y el carbono cuaternario, como se muestra en el Esquema 2.

100

Cl O H3C H3C N O CH2

Cl

+ SO4.Cl

.
H3C H3C

N O

CH2

+ HSO4-

.
H3C H3C

N O

CH2

Cl O H3C H3C

N O

CH2

Cl O H3C H3C O H3C H3C

Cl O H3C H3C N CH2 O

N O

CH2

.
Cl O

Cl N CH2

. O

CH2

H3C H3C

Esquema 2: Formacin del producto D a partir del radical orgnico generado por el ataque del SO4 al heterociclo del clomazone. La hidroxilacin del anillo aromtico (productos E y G) se produce por la reaccin del mismo con el radical sulfato por dos posibles mecanismos: transferencia electrnica o adicin / eliminacin [Gonzalez y col., 1998]. La formacin del producto G se explica por la adicin en ipso del radical sulfato al C unido al tomo de Cl del producto C. La prdida de HCl del aductos ipso fue publicada en literatura [Rosso y col., 2003; Mohan y col., 1991]. De forma similar, la adicin del radical sulfato al tomo de C unido a un grupo R en posicin orto al clorobenceno (como son el reactivo y los productos A, B, C y D), seguida de la eliminacin de RH genera el producto E. La fuerza impulsora para est reaccin esta relacionada con la habilidad saliente del grupo RH. En la Tabla 5.1 se observa que los primeros productos en aparecer son aquellos que estn ms reducidos. A mayores tiempos de fotlisis se van consumiendo estos productos y aparecen otros de mayor estado de oxidacin. A tiempos ms largos an, aparecen los productos hidroxilados, los cuales se forman por el ataque del radical sulfato a los productos anteriores. Para la fotlisis con luz de exc > 200 nm de soluciones de clomazone se identificaron los productos: alcohol 2-clorobenclico (A) y 2-clorobenzaldehido (B). Se conoce que la fotlisis de las 5-isoxasolidonas sustituidas en el N tanto por cadenas alifticas como aromticas (el clomazone es una 3- isoxasolidona), produce la ruptura del heterociclo y su posterior oxidacin con prdida de CO2 [Beccalli y col., 2003]. Por otro lado, Russo-Caia y Steenken observaron que la fotlisis lser a 248 nm de metilbencenos en solucin acuosa genera el electrn hidratado y el 101

correspondiente radical catin por fotoionizacin [Russo-Caia y Steenken, 2002]. La prdida de un protn del grupo metilo del radical catin genera la formacin de radicales bencilo [Russo-Caia y Steenken, 2002]. La deteccin de los productos A y B nos permite proponer la posible participacin de radicales bencilo como intermediarios de reaccin (como se mostr en el Esquema 1). Esto indica que en nuestras condiciones experimentales, la energa de la luz empleada sera suficiente para fotoionizar al compuesto, o a sus productos de oxidacin. Esto resultados estn de acuerdo con la obtencin de A y B como los productos principales detectados en la fotodegradacin de este herbicida en agua destilada y en aguas de irrigacin de campos de plantacin de arroz [Zanella y col, 2008]. Se intent obtener informacin de los intermediarios de la reaccin del radical sulfato con el clomazone, registrando sus espectros por flash-fotlisis. En los ensayos realizados con flashfotlisis convencional, los tiempos son muy largos y no pueden separarse los espectros de las especies generadas. Mientras que en los experimentos de lser flash-fotlisis no pueden obtenerse datos por debajo de 300 nm, regin en la que es ms importante la absorbancia de los radicales orgnicos, debido a la alta absorbancia de las soluciones de trabajo. Nascimento y col. [Nascimento y col., 2007] estudiaron la remediacin de aguas naturales (conteniendo clomazone y otros contaminantes) por procesos foto-Fenton con Fe(II), H2O2, y luz solar. Los autores mostraron que a bajas concentraciones del contaminante, ms del 90% del contenido de carbono orgnico total se mineralizaba en alrededor de 2 a 3 horas, utilizando reactores solares de diferentes geometras.

Ensayos en presencia de peroxodisulfato y sustancias hmicas. Como se mostr en el captulo anterior, las SH disminuyen la vida del radical SO4, modificando la eficacia de los tratamientos oxidativos in situ. Para observar el efecto de las SH en la degradacin del herbicida por el radical SO4 se realizaron ensayos de irradiacin continua de soluciones acuosas del herbicida en presencia de: (1) 10-3 M de Na2S2O8, (2) de 5 ppm de AHA, y (3) de 5 ppm de AHA y 10-3 M de Na2S2O8. Los resultados de degradacin del contaminante y de mineralizacin del mismo se muestran en la Figura 5.3. Se observa que el contaminante se degrada eficientemente tanto por sensibilizacin por AHA como por oxidacin por el radical SO4, como se observa en la Figura 5.3. Sin embargo, no se observ una degradacin mayor cuando se utiliz Na2S2O8 y AHA juntos. Esto puede deberse a que la luz que llega a la muestra es absorbida por ambas especies. Con respecto a la mineralizacin de la muestra, se observa que sta es ms efectiva por oxidacin con peroxodisulfato en ausencia de SH. En el tratamiento conjunto con Na2S2O8 y AHA la mineralizacin es menor, mientras que en las condiciones de trabajo la fotosensibilizacin con SH es intermedia entre estas dos. Sin embargo, se observa que con estas 102

condiciones, no se alcanza una mineralizacin eficiente de la muestra. Si bien la degradacin del herbicida es igualmente eficiente en las tres condiciones empleadas, su grado de mineralizacin disminuye debido principalmente a que en presencia de Na2S2O8 y AHA, los radicales sulfato generados reaccionan tanto con el contaminante como con la materia orgnica presentes en la solucin (ver Captulo IV, esquema 4.1).

100

110 100

% degradacin Clomazone

80 TOC 60 40

90 80 70 60 50 0 20 40 60 80 100

t / min 20

0 0 20 40 60 80

t / min
Figura 5.3: Evolucin temporal de la concentracin porcentual relativa de Clomazone en soluciones del herbicida irradiadas con 5 ppm de AHA (), 10-3 M de Na2S2O8 (), y 5 ppm de AHA y 10-3 M de Na2S2O8 (). Recuadro: Evolucin temporal de la medida de TOC en las mismas soluciones.

Estudio del mecanismo de fotosensibilizacin con sustancias hmicas. Para estudiar el efecto de las sustancias hmicas en la degradacin de clomazone, se sigui la evolucin temporal de la concentracin de herbicida y el contenido de carbono orgnico durante la irradiacin con luz de exc > 300 nm. Para los ensayos con soluciones saturadas en aire, se observa que los cambios en la concentracin y el TOC son mucho ms marcados en soluciones con agregado de 20 ppm de AHA que en su ausencia, como se muestra en las Figuras 5.4 y 5.5. Para estos ensayos, la absorbancia del clomazone es menor al 10% de la de las sustancias hmicas en todo el intervalo de irradiacin de la lmpara. Como se observa en ambas figuras, la degradacin del contaminante es poco eficiente en ausencia de sustancias hmicas, por lo que el 103

proceso es fotosensibilizado por estas sustancias. Para determinar cules de las especies reactivas generadas por irradiacin de sustancias hmicas participan en la degradacin del clomazone, se realizaron experimentos utilizando AHA, Ext. OH o rosa de bengala (RB) como sensibilizadores en presencia de diferentes concentraciones de oxgeno disuelto, y/o desactivadores selectivos. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 5.5. Se observ que tanto la degradacin del herbicida como la disminucin del contenido de carbono orgnico total dependen de la concentracin de oxgeno disuelto.

1.0 0.9

C / C0

0.8 0.7 0.6 0.5 0 10 20 30 40 50

t / min
Figura 5.4: Concentracin relativa de clomazone en funcin del tiempo de irradiacin con luz de > 300 nm, para clomazone solo (), clomazone con AHA saturado en aire () y clomazone con AHA saturado en O2 (). En ensayos con soluciones del herbicida burbujeadas con Ar (para desplazar el O2 disuelto) no se observ disminucin del TOC. El mismo efecto inhibitorio en la mineralizacin de la muestra se obtuvo empleando soluciones saturadas en aire con el agregado de NaN3 (desactivador para oxgeno singulete, O2(1g) [Rubio y col., 1992] y los radicales OH [Ross y col., 1998]). Estos resultados demuestran que para exc > 300 nm el O2 (1g) es la principal especie reactiva en la fotodegradacin del clomazone.

104

1.0

TOC / TOC0

0.9

0.8

0.7 0 20 40 60 80 100

t / min
Figura 5.5: Evolucin del contenido de carbono orgnico de soluciones de clomazone irradiadas

con luz de > 300 nm, en las siguientes condiciones: solo ( con AHA y NaN3 ( ( NaN3 ( ); con AHA, saturada en Ar (

); con AHA (

);

); con Ext. OH ); con RB y

); con Ext. OH, saturada en Ar y ( ).

); con RB (

Para estos ensayos la absorbancia de la solucin de AHA es del orden de 1.5 veces mayor que la de la solucin del Ext. OH en todas las longitudes de onda de excitacin. En estas condiciones el Ext. OH y el AHA muestran eficiencias comparables para la fotodegradacin del clomazone, en concordancia con nuestra observacin previa de que la produccin de O2(1g) es ms eficiente para el Ext. OH que para el AHA (ver Figura 3.12, Captulo 3). Para tener mayor informacin del proceso de fotodegradacin, se estudi la cintica de desactivacin del O2(1g) por clomazone. La desactivacin del O2(1g) puede seguir dos vas: (i) por reaccin qumica con el sustrato con una constante de velocidad kr, y (ii) por interaccin fsica con una constante de quenching kq. En esta ecuacin, O2(3g-) es el estado fundamental del oxgeno molecular. La constante de velocidad bimolecular del proceso global contiene contribucin de los dos procesos de desactivacin kt = kr + kq.
kr O2( g) + Clomazone Productos
1

kq O2( g) + Clomazone O2(3g-) + Clomazone*

1

105

El valor de kt en D2O se obtuvo del anlisis de las trazas de fosforescencia resueltas en el tiempo (TRPD) del O2(1g) a 1270 nm (exc = 532 nm) las que se muestran en el recuadro de la Figura 5.6.

Intensidad fosforescencia

4e+5

0.015 0.010 0.005 0.000 0.0000 0.0001 0.0002

3e+5

/s

-1 1

2e+5

t/s

1e+5

0 0.000 0.001 0.002 0.003 0.004

[Clomazone] / M
Figura 5.6: Grfica para determinacin de kt. Recuadro: trazas de TRPD con 0 (en negro), 2.3

(en verde) y 3.8 mM (en rojo) de Clomazone. El tiempo de vida del O2(1g) en las soluciones en D2O con el sensibilizador, , disminuye al aumentar la concentracin del sustrato adicionado, segn la Ecuacin 5.1 [Mrtire y col., 1993]. 1/ = 1/o + kt [clomazone] Ec. 5.1 donde o es el tiempo de vida del O2(1g) en ausencia de clomazone. El grfico de 1/ vs. [clomazone] se muestra en la Figura 5.6. El valor de o en D2O obtenido a partir de la ordenada al origen del grfico, concuerda dentro del error experimental con los publicados en la literatura [Wilkinson y col., 1995]. A partir de la pendiente del ajuste lineal de los datos se obtiene un valor de kt = (5.7 0.3) 107 M-1 s-1. Del seguimiento del consumo de clomazone por HPLC (Figura 5.8) y de oxgeno disuelto con un electrodo selectivo (Figura 5.7), en experimentos de irradiacin continua de soluciones de clomazone y RB se obtuvieron el valor de kr y la estequiometra de la reaccin. Las pendientes de las rectas de pseudoprimer orden del consumo de oxgeno y del pesticida son respectivamente - (2.14 0.07) 10-5 s-1 y - (2.24 0.03) 10-5 s-1. Estos valores son iguales dentro del error 106

experimental, y por lo tanto teniendo en cuenta que el consumo de oxgeno se debe nicamente a la reaccin entre el oxgeno singulete y el clomazone, la estequiometra de sta reaccin es 1 a 1 [Garca, 1994]. Como las pendientes son proporcionales a kr, puede obtenerse el valor de la constante experimental a partir del anlisis comparativo de los resultados del consumo de oxgeno del sustrato y de una sustancia de referencia de kr conocida, en idnticas condiciones experimentales [Foote y Ching, 1975]. Se utiliz como referencia el aminocido histidina, con un valor de kr = 9.0 107 M-1s-1 [Miskoski y Garcia, 1993], y a partir del cociente de las pendientes se obtuvo el valor de kr para clomazone de (5.4 0.1) 107 M-1s-1 (Figura 5.7). Como puede observarse de los valores de kt y kr obtenidos, estos son iguales dentro del error experimental, por lo que el clomazone desactiva al oxgeno singulete por la va qumica principalmente.

0.000 -0.002 -0.004

ln (O2/O2 0)

-0.006 -0.008 -0.010 -0.012 -0.014 -0.016 0 100 200 300 400 500

t / seg
Figura 5.7: cintica de consumo del oxgeno disuelto en el ensayo con clomazone (en negro) y

con histidina (en rojo), para la determinacin de kr.

107

0.00

-0.05

ln (C/C0)

-0.10

-0.15

-0.20 0 20 40 60 80

t / min
Figura 5.8: cintica de consumo del clomazone para la determinacin de kr.

Para la degradacin de clomazone sensibilizada por AHA en soluciones saturadas en aire irradiadas con luz de exc > 300 nm, se determinaron como productos principales alcohol 2clorobenclico y 2-clorobenzaldehido (A y B en la Tabla 5.1). En estas condiciones es probable que adems de O2(1g) otras especies como el radical OH sean relevantes en la degradacin del herbicida (ver Captulo VI). El oxgeno singulete reacciona eficientemente con el anillo no aromtico, debido a su carcter electroflico. La interaccin puede ser tanto por quenching fsico como qumico. Es sabido que varios heterociclos no aromticos son oxidados por esta especie reactiva, producindose finalmente la ruptura del anillo [Iesce y col., 2007], en concordancia con los productos detectados.

108

Conclusiones:
Como se observ con otros pesticidas o herbicidas [Burrows y col., 2002], la fotodegradacin directa por luz solar es un proceso de menor importancia (como puede verse en las Figuras 5.4 y 5.5 para fotlisis con luz de > 300 nm), sin embargo en suelos y aguas naturales donde estn presentes las sustancias hmicas, la degradacin fotosensibilizada de clomazone puede ser un mecanismo eficiente para su remocin. El clomazone es eficientemente degradado en aguas naturales con concentraciones apreciables de sustancias hmicas, debido a la oxidacin por oxgeno singulete (O2 (1g)). A pesar del corto tiempo de vida de 4 s del oxgeno singulete en agua, esta especie alcanza en aguas naturales irradiadas por luz solar concentraciones en estado estacionario mayores a 10-14 M. Los resultados tambin muestran que el clomazone es eficientemente degradado por procesos avanzados de oxidacin (AOP), como por ejemplo UV/ Na2S2O8 que involucra al radical SO4 como iniciador del proceso de oxidacin (Figuras 5.2 y 5.3).

109

b.- cido tricloroactico:

Se estudi la degradacin del cido tricloroactico (ATCA) por diferentes radicales inorgnicos de carcter reductor, as como tambin la capacidad del cido hmico de degradarlo por fotosensibilizacin. Los radicales estudiados son el radical anin superxido y su cido conjugado (O2 / HO2), el radical anin CO2 y el radical hidroximetilo (CH3OH).
Fotlisis del ATCA.

El ATCA se degrada completamente a HCl, CO2 y en menor proporcin a CHCl3, por homlisis de los enlaces C-Cl y C-C inducida por luz UVC [Wu y col., 2001; Krutsko y Kulak, 2004; Lifongo y col., 2004]. Las reacciones trmicas que siguen a este proceso liberan el cloro orgnico como Cl[ Wu y col., 2001; Krutsko y Kulak, 2004; Lifongo y col., 2004; Wang y Haag, 1999]. Los experimentos de irradiacin continua de soluciones acuosas de ATCA 2.7 10-4 M saturadas en aire con luz de 185 nm y 254 nm liberan en 15 minutos 8.2 10-4 M de Cl, como puede verse en la Figura 5.9. En este ensayo se detect la formacin de formiato (HCO2 )en concentraciones menores al 1% de la concentracin inicial de ATCA. La fotlisis de la solucin de ATCA en las mismas condiciones, pero utilizando un filtro de cuarzo normal para eliminar la luz de 185 nm, genera una concentracin relativa de Cl, ([Cl]/[TCAA0]) correspondiente a la degradacin del 7 % de ATCA luego de 60 minutos (Figura 5.9). En este ensayo no se han detectado otros productos con las tcnicas analticas disponibles (lmite de resolucin < 0.5 ppm). Estos resultados se explican por el bajo coeficiente de absorcin del ATCA a > 250 nm (254 nm 5 M-1cm-1 [Wang y Haag, 1999]). La recuperacin del cloro orgnico como Cl por fotlisis de soluciones acuosas de ATCA con lmparas de Hg de media presin dopadas (Heraeus Noblelight QC2000 y EQ2023, 2kW) que emiten en casi todo el intervalo espectral UVC (exc > 210 nm) ya haba sido publicada [Wrner y col., 1998].

110

[Cl-] / [ATCA]0

0 0 10 20 30 40 50 60

t / min
Figura 5.9: concentracin relativa de cloruros, [Cl ]/ [ATCA]0, vs. el tiempo de irradiacin en

experimentos con: () solucin de ATCA 2.710-4 M y excitacin con 185 y 254 nm; () solucin de ATCA 9.710-4 M y excitacin a 254 nm () y () excitacin a 254 nm de soluciones saturadas en aire de ATCA 810-4 M y H2O2 9.810-2 M, ajustadas a pH 3.3 y 9.8, respectivamente. En experimentos blanco realizados utilizando una camisa de Pyrex alrededor de la lmpara para filtrar las lneas de 185 y 254 nm, no se detect la formacin de productos. Por lo tanto, la degradacin de ATCA por reacciones trmicas inducidas por la emisin IR de la lmpara en las condiciones experimentales utilizadas es despreciable. Para estudiar solamente las reacciones de degradacin de ATCA inducida por sustancias hmicas (HS) o por los diferentes radicales inorgnicos, los experimentos de irradiacin continua se realizaron con la luz > 240 nm. Para ello se utiliz una camisa de cuarzo natural que filtra la emisin a 185 nm de la lmpara Heraeus Noblelight, o se hizo circular por dentro de la camisa de cuarzo una mezcla de cido actico-agua en partes iguales cuando se utiliz la lmpara Philips HPK.
Radical anin superxido, O2.

La irradiacin con luz UVC (254 nm) de soluciones saturadas en aire de ATCA 810-4 M y H2O2 4.810-2 M en el intervalo de pH 3.0 - 9.8, genera bajas concentraciones de iones cloruro an para tiempos de irradiacin largos (Figura 5.9). Para relaciones de [H2O2] / [ATCA] mayores que 10, el agua oxigenada compite con el ATCA por los radicales HO. Por lo tanto, en las condiciones experimentales utilizadas, la reaccin de los radicales HO con el ATCA (reaccin 10) 111

de Tabla 5.2) no es significativa respecto a las reacciones para generar los radicales HO2 / O2 (reacciones 6 y 7 de la Tabla 5.2). La principal especie presente en soluciones alcalinas es el O2.-, que es un agente reductor moderado capaz de degradar al ATCA, segn la reaccin 8 de la Tabla 5.2. Sin embargo, los rendimientos de cloruro observados en la irradiacin de soluciones alcalinas de ATCA y H2O2 son similares a los de soluciones cidas, como se ve en la Figura 5.9. Esto indica que se espera una baja eficiencia de la reaccin del O2 con el ATCA.
TABLA 5.2: Reacciones que intervienen en la degradacin de ATCA en presencia de H2O2.
(a)

[Ross y col., 1998]. Las constantes de recombinacin se expresan como multiplicadas por 2. HO HO2 +

H2O2 O2

HO2 H+

H2O

2.7 107 M-1 s-1 (a) pKa = 4.8 (a) (1.4 0.1) 104 M-1s-1 9.7 107 M-1s-1(a) 9 106 M-1s-1(a)

(6) (7) (8) (9) (10)

O2 + CCl3CO2 Productos O2 + HO2 + H2O O2 + H2O2 + HO HO + CCl3CO2 CCl3CO2 + HO

Para evaluar la constante de velocidad de la reaccin 8, se realizaron experimentos de flash-fotlisis con soluciones de H2O2 0.0116 M y concentraciones crecientes de ATCA a pH 9. En estos experimentos, el radical anin O2 se detect a 300 nm (290 nm 560 M-1 cm-1) con una velocidad de decaimiento que aumentaba con [ATCA] (Figura 5.10). El decaimiento pudo ajustarse a una cintica mixta de primer y segundo orden (con constantes de velocidad kap y krec, respectivamente, como se muestra en las trazas de la Figura 5.10). El valor de krec = (4 1) 104 M-1 s-1 se obtuvo a pH 9, y es del orden del esperado para la reaccin entre O2 y HO2 a este pH [Bielski y Cabelli, 1995]. Si bien a este valor de pH la especie principal es el radical O2, no se observa su recombinacin por su baja reactividad [Bielski y Cabelli, 1995]. De la pendiente del grfico de kap vs. [ATCA], ver recuadro de la Figura 5.10, se obtiene el valor de k8 = 1.4104 M-1 s-1, lo que muestra la baja reactividad de O2 con ATCA, en concordancia con los experimentos de fotlisis continua. Estos resultados fueron confirmados por los potenciales de reduccin del ATCA determinados por voltamperometra de pulso diferencial [David Gara y col., 2007]. El valor determinado para la primera reduccin de ATCA a dicloroacetato contra el electrodo normal de hidrgeno (ENH) es de -600 mV, el cual es mayor al del radical O2( E (O2/ O2 = )- 330 mV [Wardman, 1989]). En cambio, los radicales CO2 y CH3OH poseen el potencial necesario para la reduccin del ATCA (E (CO2/CO2 )2000 mV y E (CH2OH / CH2O) - 740 a - 930 mV, ambos contra el ENH [Wardman, 1989]).

112

0.05

100 80

0.04

k prim (s-1)

60 40 20

0.03

0.02

(a)

0 0 1x10-3 2x10-3 3x10-3 4x10-3 5x10-3 6x10-3

0.01

[ATCA] / M

0.00

(b)
0 1 2 3 4

t/s
Figura 5.10: Trazas observadas a 280 nm en experimentos de flash-fotlisis en soluciones 0.0116

M de H2O2 saturadas en oxgeno a pH 9.0 0.3, en presencia de (a) 0 M y (b) 110-3 M ATCA, respectivamente. Las lneas llenas corresponden a los ajustes. Recuadro: Grfico de kprim vs. [ATCA]. Excepto por la absorcin del O2, no se detect ninguna otra contribucin a det entre 270 y 550 nm lo que indica que los radicales formados a partir de la reaccin 8, o no absorben a estas longitudes de onda o tienen tiempos de vida menores que 0.05 s.

Radical anin dixido de carbono, CO2 .

La excitacin UV-C (254 nm) de soluciones saturadas en aire con 8 10-4 M de ATCA, 5 10-2 M de H2O2 y 1.3 10-2 M de cido frmico a pH 3.3 condujo a casi un 100 % de recuperacin del cloro orgnico como cloruro despus de 20 minutos de fotlisis (Figura 5.11).

113

[Cl-] / [TCAA]0

[H2CO2]T / M

0.010

0.005

0.000 0 20

0 0 20 40

t / min

40

60

60

80

t / min
Figura 5.11: [Cl]/[ATCA]0, vs. tiempo de irradiacin para fotlisis UVC (254 nm) de soluciones

saturadas en aire de ATCA 8 10-4 M, H2O2 5 10-2 M y formiato 1.3 10-2 M a pH 3.3.
Recuadro: Concentracin total de formiato, [H2CO2]T , vs. el tiempo de irradiacin para los

mismos experimentos. Las lneas azules de la figura principal y el recuadro representan los ajustes con las ecuaciones 5.2 y 5.3, respectivamente. En los experimentos de pH 3.3 hay presentes tanto cido frmico (pKa = 3.75) como formiato con una relacin de concentraciones 2.8:1. La velocidad de consumo del cido frmico total, [H2CO2]T = [H2CO2] + [HCO2-], y los perfiles de concentracin de iones cloruro pudieron ajustarse a un decaimiento de primer orden y crecimiento exponencial, respectivamente (lneas azules de la Figura 5.11), segn las siguientes ecuaciones:

[H 2CO 2 ]T ,t = [H 2CO 2 ]T ,o e k H 2 CO 2 t

Ec. 5.2

Donde [H2CO2]T,t y [H2CO2]T,o son las concentraciones de formiato total a tiempo t y a tiempo 0, respectivamente, y kH2CO2 es la constante de velocidad global de consumo de formiato.
Cl t = Cl final 1 ekCl t [ ATCA]o [ ATCA]o

Ec. 5.3

Para la cual [Cl-]t y [Cl-]final son respectivamente las concentraciones de cloruro a tiempo t y a tiempos de irradiacin largos donde no se observan ms cambios en su concentracin. 114

[ATCA]o es la concentracin inicial de ATCA y kCl- es la constante de velocidad aparente de produccin de Cl. Los valores de kCl- = 2.4 10-3 s-1 y kH2CO2 = 1.4 10-3 s-1 obtenidos del ajuste de las curvas indican que la velocidad de formacin de Cl es 1.5 veces mayor que la velocidad de consumo de cido frmico total. Como ya se discuti, se supone que el radical anin CO2 es la principal especie que consume ATCA en nuestras condiciones experimentales. Por lo tanto, la prdida de tres tomos de cloro como iones cloruro involucra el consumo de dos radicales aniones CO2. Los experimentos de fotlisis estacionaria realizados bajo burbujeo con aire no condujeron a la recuperacin estequiomtrica del cloro orgnico como cloruro. Estas observaciones sugieren que el oxgeno molecular disuelto compite por ATCA con los radicales CO2, reacciones 11 y 12 de la Tabla 5.3. La recuperacin cuantitativa de ATCA observada con un valor inicial de oxgeno disuelto ([O2]dis) de 2.5 10-4 M en un reactor cerrado, sugiere que el oxgeno molecular se consume eficientemente por la reaccin 12 hasta que la relacin desfavorable k11 [ATCA] k12 [O2]dis se revierte.
TABLA 5.3: Reacciones que intervienen en la degradacin de ATCA en presencia de H2CO2.
(a)

[Ross y col., 1998]. Las constantes de recombinacin se expresan como multiplicadas por 2. CO2 + CCl3CO2-

CCl2CO2 + Cl- + CO2

(2 1) 107 M-1s-1 (3 1) 109 M-1s-1 (a) (8 2) 109 M-1s-1

(11) (12)

CO2 + O2 O2 + CO2 CO2 + CO2 C2O42

(2.5 0.2) 108 M-1 s-1 (13) (14) (15) (16) (4 1) 109 M-1s-1 (17)

CCl2CO2 + CO2

CClCO2 + Cl- + CO2

CClCO2 + H2O Cl(HO)CH-CO2

H(O)C-CO2 + H+ + Cl

Cl(HO)CH-CO2

CCl2CO2- +

CCl2CO2( O2C_CCl2_CCl2_CO2)

Se realizaron experimentos de flash-fotlisis para obtener informacin sobre el mecanismo de reaccin de CO2 con ATCA, reaccin 11 en la Tabla 5.3. Para evitar la interferencia del O2, el CO2 se gener por reaccin del HCO2 con el radical sulfato (SO4) formado por fotlisis de peroxodisulfato. Los experimentos de flash-fotlisis con soluciones acuosas de ATCA 1 10-3 M, en ausencia o presencia de formiato 1 10-2 M, no mostraron la formacin de especies transientes. En experimentos con soluciones de peroxodisulfato 1 10-3 M, se observ la formacin de SO4( ver 115

curva (a) del recuadro de la Figura 5.12). Experimentos similares con S2O82 1 10-3 M y ATCA 1 10-3 M tambin muestran la formacin del radical SO4, cuyo decaimiento es independiente de [ATCA]. A partir de los resultados experimentales se estim el lmite superior para esta constante de velocidad como 2 105 M-1 s-1, el cual est de acuerdo con el valor publicado (k < 2 106 M-1 s-1 [Ross y col., 1998]). Cuando se realizan experimentos con 5 10-3 M peroxodisulfato y 1 10-2 M formiato no se observa la seal correspondiente al radical SO4, pero s a un transiente que absorbe a det < 350 nm, como se puede ver en las trazas (b) y (c), en la Figura 5.12. Este radical fue asignado a CO2, generado por reaccin de SO4 con formiato y cido frmico, como se corrobor posteriormente debido a la similitud de su espectro con el publicado para el CO2[ Hug, 1981]. El decaimiento observado para el radical CO2 es de segundo orden, con 2 k / 260 nm = 1.16105 cm s-1. Tomando para este radical el valor de literatura de 260 nm 2190 M-1 cm-1 [Hug, 1981], el valor obtenido para 2 k = 2.5108 M-1 s-1 a fuerza inica 0.01 M est de acuerdo con el publicado para la reaccin 13 de la Tabla 5.3. Por otro lado, experimentos con soluciones saturadas en Ar con 5 10-3 M de peroxodisulfato en presencia de 1 10-2 M formiato y 1 10-3 M de ATCA, mostraron la formacin de transientes en el intervalo de longitudes de onda de 270 a 330 nm, con un mximo a 290 nm, ver trazas (d) de la Figura 5.12, donde se superponen dos seales con distintas ventanas de tiempo. Un anlisis bilineal de estos resultados experimentales revel la presencia de dos especies. La especie de menor tiempo de vida se asign al radical CO2, por su espectro de absorcin (Figura 5.13, crculos verdes) [Hug, 1981]. La especie de mayor tiempo de vida (Figura 5.13, tringulos verdes) se asign al radical anin CCl2CO2. Bae y Choy postularon al radical

CCl2CO2 como un intermediario en la reduccin secuencial de ATCA a dicloroacetato por

TiO2/Pt [Bae y Choi, 2003]. La formacin de CCl2CO2 por la reaccin 11 est apoyada por la coincidencia con el espectro publicado [Roman y col., 1997] y por la fuerte dependencia de su decaimiento con la concentracin de ATCA [Hart y Anbar, 1970]. Adems, no se detecta absorcin del CCl2CO2 en experimentos realizados en las mismas soluciones saturadas en aire, como se espera de la competencia entre la reaccin 11 y la 12 para dar principalmente O2 /HO2 en lugar del radical CO2. Como se mencion anteriormente, la reaccin de O2 con ATCA no genera radicales detectables a longitudes de onda > 270 nm. Como se observa del decaimiento de las seales experimentales (trazas (d) en la Figura 5.12), la recombinacin del CCl2CO2 es la principal reaccin que consume este radical, reaccin 17 de la Tabla 5.3.

116

0.05 0.04 0.03

0.04

(a)

(c)

0.02

0.00

(b)
0 1x10-3 2x10-3 3x10-3 4x10-3

0.02

t / seg

(d)
0.01 0.00 0.000 0.002 0.004 0.006

t / seg
Figura 5.12: Transientes correspondientes a soluciones 510-3 M de Na2S2O8 de pH 5.0 en las

siguientes condiciones: a: det = 450 nm, b y c: en presencia de 0.01 M [H2CO2]T, det = 450 nm y 260 nm, respectivamente; y d: con el agregado de 0.01 M [H2CO2]T y 110-3 M ATCA, det = 300 nm. Las lneas llenas corresponden a las simulaciones cinticas. Para confirmar los mecanismos propuestos y obtener datos cinticos precisos de los experimentos resueltos en el tiempo, se realizaron simulaciones computacionales de los comportamientos cinticos de las especies involucradas, utilizando un programa basado en el mtodo de Runge-Kutta de resolucin de ecuaciones diferenciales. En estas simulaciones se consideraron las reacciones 11 a 17 listadas en la Tabla 5.3, y las reacciones de pseudo primer orden del radical sulfato (con HCO2H y HCO2, H2O, OH y S2O82 )y su recombinacin bimolecular [Ross y col., 1998]. Como se describi en captulos anteriores, la concentracin inicial de radical SO4.-se estim a partir de datos experimentales realizados en las mismas condiciones pero en ausencia de sustratos (traza a en la Figura 5.12), y tomando el valor de 450 nm (SO4= ) 1650 M-1 cm-1 [McElroy y Waygood, 1990]. En ausencia de ATCA, el programa de simulacin genera perfiles de absorcin de CO2 que ajustan muy bien los resultados experimentales (traza c de la Figura 5.12). Se obtuvieron buenos ajustes de los datos experimentales en presencia de ATCA 1 10-3 M con valores de 295 nm (CCl2CO2( = )2000 500) L mol-1 cm-1, k11 = 2 107 M1 -1

s y 2 k17 = 4 109 M-1s-1. Tambin se confirm la contribucin despreciable de las reacciones El valor obtenido para 2 k17 de 4 109 M-1s-1 es del orden de los publicados para

del CCl2CO2 con el solvente y el anin peroxodisulfato. constantes de velocidad de recombinacin de radicales halogenados centrados en el carbono 117

[Roman y col., 1997; Ross y col., 1998]. La recombinacin del CCl2CO2 es la principal reaccin de terminacin en los experimentos de flash-fotlisis, y se supone que genera cido tetraclorobutanodioico como producto de reaccin. Se realizaron anlisis por HPLC de soluciones de ATCA 1 10-2 M, HCO2H 1 10-2 M y S2O82 5 10-3 M, fotolizadas con cinco disparos del equipo de flash-fotlisis convencional. En estos ensayos se detect la presencia de dos picos, uno ms grande que coincide con el ATCA, y el otro pequeo a tiempos de retencin ms largos que el anterior y que por lo tanto puede atribuirse a una molcula ms polar que el ATCA. Sin embargo, no se espera observar el pico correspondiente al cido tetraclorobutanodioico debido a su inestabilidad trmica [March, 2001].

2000 1500 1000 500 0

/ M cm

-1

-1

260

280

300

320

/ nm
Figura 5.13: Espectro de absorcin de CO2( crculos) y CCl2CO2( tringulos) obtenidos del

anlisis bilineal de soluciones saturadas en Ar en las siguientes condiciones: () pH 5.0, 5 10-3 M Na2S2O8, y 0.01 M [H2CO2]T; () y () pH 5.0, 5 10-3 M Na2S2O8, 0.01 M de [H2CO2]T, y 2 10-3 M de ATCA; y () pH 3.1, 1 10-3 M de Na2S2O8, 0.01 M de MeOH y 1 10-3 M de ATCA. Las lneas corresponden a los espectros publicados para ambos radicales. En los experimentos de irradiacin continua no se detectaron productos alifaticos clorosustituidos. Esto puede explicarse porque en estos experimentos se genera continuamente CO2, el que se requiere para la posterior reduccin del CCl2CO2 para dar finalmente CO2, HCl, y pequeas cantidades de C2O42-. Se postula la formacin de un clorocarbeno (CClCO2 )como intermediario de reaccin, el cual se hidroliza al correspondiente derivado clorhidrina (Cl(HO)CHCO2), el que posteriormente se descompone en HCl y glioxilato (H(O)C-CO2[ )Hine, 1950; Ross y col., 1998], reacciones 14 a 16 en la Tabla 5.3. De hecho, las simulaciones de los decaimientos 118

de los transientes observados experimentalmente fue posible nicamente incluyendo la reaccin 14 en el mecanismo con una constante de velocidad k14 = (8 2) 109 M-1 s-1. El espectro de absorcin y el coeficiente de absorcin molar obtenidos para el radical

CCl2CO2 son similares a los publicados para radicales dihalo acetato sustituidos [Roman y col.,

1997]. El espectro obtenido por dos mtodos independientes para generar dicho radical, se encuentra corrido al azul 5 nm con respecto al publicado [Roman y col., 1997], como se observa en la Figura 5.13 (tringulos: datos experimentales, lnea punteada: espectro publicado).
Radical hidroximetilo, CH3OH.

Soluciones saturadas en aire con 8.610-4 M ATCA, 510-2 M H2O2 y 9.110-4 M CH3OH a pH 3.5 mostraron una recuperacin total del cloro orgnico del ATCA como ion cloruro despus de 20 minutos de irradiacin a 254 nm (Figura 5.14). Se detect la formacin de concentraciones milimolar de formiato y micromolar de oxalato, que acompaaron a la prdida de cloruro (Figura 5.14). La formacin de concentraciones ms altas de formiato con respecto al ion cloruro indica que ms de una molcula de MeOH se oxida por cada molcula de ATCA mineralizada. Por otro lado, cuando el ion cloruro alcanza su valor mximo, el ion oxalato tambin alcanza su mxima concentracin y posteriormente es consumido por el sistema de reaccin, sugiriendo que el oxalato es un intermediario en la mineralizacin del ATCA a CO2 y HCl. Para obtener mayor informacin cintica y sobre el mecanismo de la reaccin entre el radical CH2OH y ATCA, reaccin 18 de la Tabla 5.4, se realizaron experimentos de flashfotlisis. No se observaron seales en los experimentos de flash-fotlisis convencional con soluciones acuosas de ATCA 1 10-3 M y CH3OH 1 10-2 M a las que se les elimin el O2 disuelto burbujeando con Ar. Tampoco se observaron seales a longitudes de onda de deteccin > 270 nm en ensayos realizados con soluciones burbujeadas con Ar de Na2S2O8 1 10-3 M y CH3OH 1 10-2 M, lo que indica que los radicales SO4 generados se consumen por su reaccin con el CH3OH para generar el correspondiente radical CH2OH [Ross y col., 1998]. Experimentos con soluciones similares que contenan adems ATCA 1 10-3 M mostraron la formacin de un transiente que absorbe a longitudes de onda < 330 nm. El anlisis bilineal de las trazas experimentales muestra la presencia de una nica especie, con un espectro muy similar al del radical anion CCl2CO2, como puede verse en la Figura 5.13. El transiente observado se asign por lo tanto a este radical como producto de la reaccin entre el radical reductor hidroximetilo y el ATCA, reaccin 18 [Hart y Anbar, 1970].

119

Figura 5.14: [Cl]/[ATCA]0 (), [HCO2]/[ATCA]0 (), y 500 [C2O42]/[ATCA]0 () en

funcin del tiempo de irradiacin para fotlsis a 254 nm de soluciones saturadas en aire de pH 3.5 con 8.6 10-4 M ATCA, 5 10-2 M H2O2 y 9.1 10-4 M CH3OH. Recuadro: Perfiles de absorcin a 290 nm obtenidos en experimentos de flash-fotlisis con soluciones saturadas en Ar de 1 10-3 M Na2S2O8 a pH 3.1 con 0.01 M CH3OH y 1 10-3 M ATCA. Las lneas llenas de la figura principal y el recuadro corresponden a las simulaciones computacionales de los datos experimentales.
TABLA 5.4: Reacciones que intervienen en la degradacin de ATCA en presencia de MeOH.
(a)

[Ross y col., 1998]. Las constantes de recombinacin se expresan como multiplicadas por 2.

CH2OH + CCl3CO2 + H2O CCl2CO2- + Cl + CH2(OH)2 + H+ CCl2CO2 +

(2 1)107 M-1s-1 3 1010 M-1s-1 < 2 104 M-1s-1 4.9 109 M-1s-1(a) 1.6 109 M-1s-1 1.5 105 M-1s-1 (a)

(18) (19) (20) (21) (22) (23)

CH2OH

CClCO2 + Cl + H2CO + H+ +

CCl2CO2 + CH3OH HCCl2CO2 CH2OH + O2

CH2OH

OOCH2OH + CH2O + SO42 + H+

CH2OH + CH2OH (CH2OH)2 CH2OH + S2O82 SO4.

Los perfiles de absorbancia observados muestran un crecimiento exponencial seguido de un decaimiento mixto de primer y segundo orden, como se observa en el recuadro de la Figura 5.14 para det = 290 nm. Se realizaron simulaciones de los perfiles cinticos, por resolucin de ecuaciones algebraicas por el mtodo de Runge-Kutta, formulado con un conjunto de reacciones 120

que incluyen las reacciones 15 a 23 de las Tablas 5.3 y 5.4, y las reacciones de primer y segundo orden del radical SO4. Para el clculo de la concentracin inicial de radical SO4 se consider nuevamente al flash de luz como una funcin delta que gener [SO4.-]0 = 4.610-6 M en estos ensayos. En la Figura 5.14 se muestra la concordancia entre los resultados experimentales y los simulados, con valores de k18 = 2 107 M-1s-1 y 2 k17 = 5109 M-1s-1. El valor de k17 es similar al obtenido en los ensayos en los que la especie reactiva es el radical CO2. El valor determinado para la constante de velocidad de la reaccin entre CCl2CO2 y CH2OH es k19 = 3 1010 M-1s-1. Este mecanismo propuesto indica que se necesitan dos radicales CH2OH para liberar los tres sustituyentes cloro del ATCA, lo que se confirma por los resultados de irradiacin continua. El clorocarbeno formado en la reaccin 19 se hidroliza posteriormente como se postul en la reacciones 15 y 16. La abstraccin de H del CH3OH por el radical CCl2CO2, reaccin 20 en la Tabla 5.4, genera radicales CH2OH que puedan reaccionar con el ATCA induciendo un mecanismo en cadena. El programa de simulacin predice un valor de k20 < 2 104 M-1 s-1, en concordancia con los valores publicados para la abstraccin de H de CH3OH por radicales alifticos halogenados [Ross y col., 1998], por lo que se descarta la importancia de un mecanismo en cadena.

Fotosensibilizacin con sustancias hmicas.

Para estudiar la fotosensibilizacin por sustancias hmicas en la degradacin de ATCA, se sigui la evolucin de la concentracin de cloruro y del contenido de carbono orgnico total (TOC) en el tiempo de irradiacin para exc > 250 nm. Para los ensayos con soluciones de ATCA 1
10-3 M y 20 ppm de AHA saturadas en Ar, se observa que la variacin del TOC y la liberacin

de Cl son mucho ms marcados, como se muestra en las figuras 5.15 y 5.16. En soluciones de ATCA y AHA saturadas en aire, la mineralizacin del cido es un poco menor que en Ar, pero no hay una significativa liberacin de Cl. Luego de 90 minutos de irradiacin en presencia de sustancias hmicas el valor de TOC disminuye al 70% del valor inicial (Figura 5.15). La degradacin del contaminante es poco significativa en ausencia de AHA, por lo que el proceso es sensibilizado por SH.

121

100

TOC relativo

90 80 70 60 0 20 40 60 80 100

Tiempo / min
Figura 5.15: evolucin temporal del TOC relativo durante la irradiacin de soluciones acuosas de

ATCA 1 10-3 M (en verde), o la misma solucin con 20 ppm de AHA, saturada en aire (en azul) o en Ar (en rojo).

1.2

[C l ] / [ATCA]0

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 20 40 60 80 100

Tiempo / min
Figura 5.16: evolucin temporal de la concentracin de cloruro relativa ([Cl]/[ATCA]0) durante

la irradiacin de soluciones acuosas de ATCA 1 10-3 M (en verde), o la misma solucin con 20 ppm de AHA, saturada en aire (en azul) o en Ar (en rojo).

122

Conclusiones:
El cido tricloroactico (ATCA) se degrada eficientemente mediante radicales reductores. Los radicales CO2 y CH2OH son ms eficientes que el radical anin superxido en la degradacin reductiva del contaminante, pero menos que el electrn hidratado (k(eaq +ATCA) = 8.5109 M-1 s-1 [Ross y col., 1998]). Se propone para estos radicales (CO2 y CH2OH) un mecanismo de reaccin comn que genera al radical CCl2CO2 y Cl, similar al propuesto para la dehalogenacin reductiva por el electrn hidratado [Hart y Anbar, 1970]. El radical CCl2CO2 se degrada posteriormente por reacciones trmicas hasta la completa mineralizacin del ATCA a CO2 y Cl. Se observ que el oxgeno molecular compite con en ATCA por los radicales CO2 y

CH2OH. Sin embargo, en ensayos de irradiacin continua en reactores cerrados, se consume el

oxgeno disuelto inicialmente por reaccin con estos radicales hasta que se ve favorecida la reaccin de los radicales con el ATCA. La tendencia observada en las constantes de velocidad de reaccin, k(O2 + TCAA) <
k(CH2OH + TCAA), k(CO2 + TCAA) < k(eaq + TCAA), es similar a la de los potenciales de

oxidacin del radical respectivo. Estas observaciones estn de acuerdo con el mecanismo de reaccin que plantea inicialmente la reduccin del ATCA. El potencial de reduccin medido mediante la tcnica de voltametra diferencial de pulso (DPV) para el ATCA, E(CCl3CO2/[CCl2CO2-]), es del orden de los -600 mV contra el electrodo normal de hidrgeno (ENH). Este valor es mayor al publicado para el radical O2, de -330 mV contra el ENH [Wardman, 1989]. Esto puede deberse ya sea por que el O2 reacciona por un mecanismo de reaccin diferente con el ATCA que los otros radicales, o porque las condiciones experimentales para los experimentos cinticos y electroqumicos son muy diferentes. Los procesos empleados para degradar al ATCA (H2O2/UVC/H2CO2 y H2O2/UVC/CH3OH, o los que emplean K2S2O8 en vez de H2O2 como oxidante) mostraron ser muy eficientes, a la vez que son econmicos y no generan residuos txicos luego de su empleo. Evidentemente, la fotosensibilizacin por sustancias hmicas (SH) produce eaq que reacciona con el ATCA en forma eficiente. Sin embargo en medios naturales, en los que no puede obviarse la presencia de O2 disuelto, la fotosensibilizacin por SH es de esperar que resulte de baja eficiencia, y adems no lleve a la liberacin del cloro orgnico como cloruro, sino que genere otros productos clorados.

123

Captulo VI.- Fotodegradacin de sustancias hmicas.

Se investig el rol de las especies reactivas de oxgeno (ROS, de su sigla en ingls) en la degradacin de las sustancias hmicas (SH) y la produccin de compuestos biodisponibles a partir de ellas. Para ello se estudi el efecto de la fotlisis con exc > 320 nm, de diferentes SH: cido hmico Aldrich (AHA) y extracto de suelo (Ext. S). Se utilizaron distintas tcnicas espectroscpicas, y se ensayaron diferentes desactivadores para inhibir las ROS generadas por fotosensibilizacin de las SH. Para determinar la capacidad de aumentar la biodisponibilidad de las SH, se sigui el desarrollo de dos cultivos bacterianos (una cepa de Pseudomonas sp. aislada del suelo y una cepa de referencia de Escherichia coli) en distintos medios de cultivo suplementados con los sustratos fotolizados o sin fotolizar.

a.- Experimentos fotoqumicos.

Se midieron los espectros UV-visible de soluciones de AHA en diferentes condiciones para investigar el efecto de las ROS en la fotodegradacin de SH. Los espectros de absorcin de las SH son muy sensibles a los cambios generados por fotlisis [Scully y col., 2003]. En la Figura 6.1 se muestra el espectro de absorcin de una solucin de AHA 0.1 g L-1 en aire, sin irradiar. En el recuadro se observan los cambios producidos en la absorcin luego de irradiar la muestra durante 90 min, en soluciones con diferente concentracin de oxgeno disuelto. Como puede observarse, los cambios en el espectro son mayores a mayor concentracin de oxgeno, como se espera del efecto de las ROS en la fotodegradacin del AHA. Sin embargo, en soluciones saturadas en Ar, se observan pequeos cambios, debidos a estados excitados de las SH y otras vas reactivas como por ejemplo mediante el radical OH [Goldstone y col., 2002] o tal vez por procesos foto Fenton ya que las SH contienen hierro [Lovley y Blunt-Harris, 1999].

124

0.25 0.20

1.5

0.15 0.10 0.05

1.0

0.00 300 400 500 600 700

/ nm 0.5

0.0 400 500 600

/ nm
Figura 6.1: Espectro de absorcin de una solucin de AHA no irradiada. Recuadro: cambios espectrales A calculados como la absorbancia de la solucin de AHA irradiada menos la no irradiada, vs. para soluciones saturadas en: oxgeno (); aire (); y Ar (). Para determinar cuales de las ROS generadas son las responsables de los cambios en los espectros de absorcin, las soluciones de AHA se fotolizaron en presencia de los agentes desactivadores listados en la Tabla 6.1 y los resultados se muestran en la Figura 6.2. Se observa que ninguno de los desactivadores utilizados suprimi completamente los cambios espectrales, lo que indica que son varias las especies responsables de estos cambios. Los cambios son ms inhibidos por la presencia de NaN3 e isopropanol que por la enzima superxido dismutasa (SOD), por lo que principalmente se deben a O2(1g) y HO, y en menor medida al O2. Para evaluar el efecto del agua oxigenada en la degradacin de las SH, se mezclaron soluciones de AHA 0.1 g L-1 y H2O2 1 M, concentracin mucho mayor a la que se formara durante la fotlisis de SH, observndose en este caso cambios muy pequeos, lo que indica que el H2O2 tampoco es una ROS importante para mediar la fotodegradacin de las SH. Para corroborar estos resultados, se determinaron las concentraciones en estado estacionario de HO y O2 (1g), durante la irradiacin de AHA. Para su determinacin se irradiaron soluciones de AHA en presencia de fenol o alcohol furfurlico como sondas para HO y O2(1g) [Kohn y Nelson, 2007], respectivamente, y se sigui su consumo por HPLC.

125

0.2

0.0

ln ([S]o/[S])

-0.1

-0.2

0.1

20

40

60

80

t / min

0.0 400 500 600

/ nm
Figura 6.2: A vs para soluciones de AHA saturadas en aire con: () NaN3 10 mM, () isopropanol 10 mM, () 1 10-2g L-1 de SOD 15 UI/L. Recuadro izquierdo: cintica de consumo de las diferentes sondas (S): fenol () y alcohol furfurlico (). Tabla 6.1: Desactivadores y sondas para las diferentes ROS en los experimentos de la Figura 6.2, y las concentraciones en estado estacionario de las mismas [ROS] ee. ROS O2(1g) HO O2 Desactivadores NaN3 10 mM Isopropanol 10 mM 1 10-2g L-1 de SOD15 UI L-1 Sonda Alc. furfurlico Fenol [ROS] ee / M 8.9 10-12 1.3 10-13 -

El fenol y el ion fenxido, adems de reaccionar con los radicales HO, son capaces de reaccionar con el O2 (1g) con constantes de velocidad de 1.3 106 M-1s-1 y 2.8 108 M-1s-1, respectivamente [Scurlock y col., 1990]. Para determinar el efecto del O2 (1g) se sigui la variacin del pH durante la fotlisis para obtener informacin de la especiacin del fenol. Durante la fotlisis, el pH disminuye de 9.3 a 7.8, siempre por debajo del pKa del fenol = 10.0 [Barlin y Perrin, 1966]. Se calcularon los lmites superiores de velocidad para la desactivacin de fenol y fenolato por O2(1g), como el producto de la constante de velocidad bimolecular por su respectiva concentracin inicial, siendo 2.9 103 y 1.5 102 s-1 para los ensayos a pH 9.3 y 7.8, 126

respectivamente. En estas condiciones experimentales la va de desactivacin principal del O2(1g) es con el solvente (constante de velocidad de pseudo primer orden = 2.5 105 s-1, correspondiente a los 4.2 s de tiempo de vida [Schmidt y Afshari, 1992]) y por lo tanto puede utilizarse al fenol como sonda para HO, sin interferencia del O2(1g). Los grficos de decaimiento de primer orden para ambas sondas se muestran en el recuadro de la Figura 6.2. De las pendientes de stos se obtuvieron las concentraciones de estado estacionario para ambas especies multiplicadas por la constante de quenching bimolecular correspondiente, kq. A partir de los valores publicados para kq para el alcohol furfurlico con O2(1g) y el fenol con HO (1.2108 M-1s-1 [Haag y Hoign, 1986] y 1.41010 M-1s-1 [Kochany y Bolton, 1991], respectivamente), se obtuvieron los valores de [1O2]ee = 8.910-12 M y [HO]ee = 1.310-13 M (Tabla 6.1). La baja concentracin de fenxido en estos ensayos, el cual tambin reacciona con HO con una constante de velocidad de 9.6 109 M-1s-1 [Matthews y Sangster, 1965] no afecta la [HO.]ee dentro del error experimental. Estos valores de concentracin en estado estacionario para ambas especies justifica la inhibicin de los cambios espectrales por NaN3 e isopropanol. Las condiciones de irradiacin y [HO.]ee son similares a las empleadas en muchos mtodos de oxidacin avanzada (AOP, Advanced Oxidation Processes) de degradacin de contaminantes, pero mucho mayores a las obtenidas en aguas naturales con irradiacin por luz solar [Sulzberger y col., 1997], permitindonos observar en tiempos cortos de irradiacin cambios apreciables en los espectros de absorcin. Se realizaron adems medidas de fluorescencia y FTIR del AHA y del Ext. S, ambos fotolizados y sin fotolizar. Los espectros FTIR muestran una disminucin de las bandas de 13801400 cm-1 (deformacin de OH, stretching de CO de fenoles, stretching anti simtrico de COOy deformacin de CH aliftico) y de 1440- 1460 cm-1 (deformacin de CH aliftico en cidos grasos y lpidos de cadena larga producidos en el proceso de compostaje), y un incremento en la de 1030-1080 cm-1 asignado al stretching C-O-C de carbohidratos [Lguirati y col., 2005] durante la irradiacin, como se observa en la Figura 6.3. Las matrices de excitacin-emisin de fluorescencia (MEEF) del AHA y el Ext. S muestran un incremento con la irradiacin en la zona de exc < 250 nm y em < 350 nm, asignada a los productos secundarios solubles del metabolismo microbiano y a molculas aromticas pequeas [Coble, 1996].

127

0.5

0.4

Transmitancia

0.3

Ext. S

0.40

0.35

0.30 4000 3000 2000

Ext. S fotolizado
1000

Nmero de onda / cm

-1

Figura 6.3: espectros FTIR del Ext. S fotolizado (en rojo) y sin fotolizar (en azul).

550 500 450

550

500 450

exc

350 300 250 200 300

exc
350 400 450 500 550 600

400

400 350 300 250 200 300

350

400

450

500

550

600

em

em

Figura 6.4: MEEF de A) Ext. S y B) Ext. S fotolizado. Ambas matrices fueron obtenidas en solucin acuosa a pH 7, A550 = 0.050, como se describi en el captulo de Materiales y mtodos. Las lneas corresponden al Raman de primer y segundo orden.

128

b.- Experimentos microbiolgicos Para determinar el efecto de la irradiacin de SH en su degradacin y posterior biodisponibilidad, se sigui el desarrollo de bacterias creciendo en medios de cultivo suplementados con los AHA o Ext. S, ambos fotolizados o sin fotolizar. El extracto posee un alto contenido de SH, como se observa en las MEEF. Se realizaron experimentos con una cepa de referencia de E. coli, para obtener informacin del sistema para luego disear los ensayos con la cepa B de Pseudomonas sp. que fue aislada del mismo suelo del que se obtuvo el extracto. Curtis y col. [Curtis y col., 1992] observaron con bacterias coliformes que su crecimiento en tanques de estabilizacin de residuos era afectado por la generacin de ROS por fotosensibilizacin por SH. El desarrollo bacteriano se sigui por medidas de atenuancia a 600 nm a distintos tiempos, las que correlacionan linealmente con el nmero de bacterias por mL de medio de cultivo que son capaces de crecer en placa de Petri con medio R2. En todos los experimentos microbiolgicos, las determinaciones se realizaron por duplicado, y las medidas de atenuancia mostraron una dispersin 6 %. En las tablas 6.2 y 6.3 se listan los parmetros de Gompertz obtenidos del ajuste de los datos con la Ecuacin 2.9, y los errores. Se realizaron ensayos con diferentes medios de cultivo. En los experimentos realizados con el medio mineral (MML) no se observ desarrollo con ninguna de las dos cepas bacteriana utilizadas, incluso con el agregado de los sustratos fotolizados o sin fotolizar. Cuando se emple el medio R2 se observa desarrollo de E. coli, que es incrementado por la adicin del Ext. S al medio como se puede ver en la Figura 6.5 y en la Tabla 6.2, la que lista los parmetros de Gompertz), mientras que el agregado de Ext. S previamente irradiado produce un mayor desarrollo del cultivo bacteriano. Al agregar AHA (fotolizado o sin fotolizar) al medio de cultivo no se observaron cambios apreciables en el desarrollo en la cepa de E. coli, como se ve en la Figura 6.5.

129

2.0

600 nm

1.5

Atenuancia

1.0

0.5

0.0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400

t / min
Figura 6.5: Cintica de desarrollo de E. coli (atenuancia a 600 nm vs. tiempo) en medio R2 () o R2 suplementado con: Ext. S (), Ext. S fotolizado (), AHA (), AHA fotolizado (). Las lneas slidas corresponden al ajuste de los datos con la ecuacin de Gompertz (Ec. 2.9). Tabla 6.2: Parmetros de desarrollo de E. coli en diferentes medios de cultivo.
Escherichia coli t latencia (min) 115 75 0 0 0 0 Mxima concentracin de biomasa (min-1) Atenuancia final R2 R2 + Ext. S R2 + Ext. S fotolizado R2 + AHA R2 + AHA fotolizado 0.004 0.001 0.006 0.001 0.008 0.002 0.008 0.002 0.006 0.001 1.41 0.02 1.79 0.05 2.08 0.07 1.35 0.05 1.42 0.03 UFC /mL final (7.6 0.1) 109 (9.7 0.2) 109 (1.13 0.03) 1010 (7.3 0.3) 109 (7.7 0.2) 109

Medio de cultivo

Los experimentos realizados con la cepa B muestran que, a diferencia de E. coli, ambos sustratos son capaces de favorecer el desarrollo bacteriano. Como se observa en la Tabla 6.3 y la Figura 6.6, la fotlisis de los sustratos mejora los rendimientos de los cultivos microbianos.

130

2.0
600 nm

1.5

Atenuancia

1.0

0.5

0.0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400

t / min
Figura 6.6: Cintica de desarrollo de la cepa B de P. sp. en medio R2 () o R2 suplementado con:

Ext. S (), Ext. S fotolizado (), AHA (), AHA fotolizado (). Las lneas slidas corresponden al ajuste de los datos con la ecuacin de Gompertz (Ec. 2.9).
Tabla 6.3: Parmetros de desarrollo de P. sp en diferentes medios de cultivo.
t latencia (min) 45 15 36 15 53 20 53 10 33 10 0 25 10 71 20 59 10 25 10 21 10 Mxima concentracin de biomasa (min )
-1

Medio de cultivo

Atenuancia final 1.40 0.05 1.49 0.02 2.09 0.02 1.86 0.06 1.99 0.07 2.28 0.03 2.65 0.05 1.79 0.05 1.84 0.06 1.97 0.03 1.99 0.04

UFC /mL final (7.5 0.3) 109 (8.1 0.1) 109 (1.13 0.01) 1010 (1.01 0.03) 1010 (1.08 0.04) 1010 (1.23 0.02) 1010 (1.43 0.03) 1010 (9.7 0.3) 109 (9.9 0.3) 109 (1.07 0.02) 1010 (1.08 0.02) 1010

R2 R2 + His R2 + His fotolizada R2 + Ext. S R2 + Ext. S fotolizado R2 + Ext. S + His R2 + (Ext. S + His) fotolizados R2 + AHA R2 + AHA fotolizado R2 + AHA + His R2 + (AHA + His) fotolizados

0.0202 0.0002 0.014 0.001 0.012 0.001 0.019 0.001 0.018 0.001 0.015 0.003 0.021 0.003 0.023 0.004 0.025 0.003 0.018 0.004 0.014 0.002

Para determinar el efecto de las diferentes ROS en la produccin de sustratos ms biodisponibles, se fotolizaron el AHA y el Ext S en presencia de desactivadores para el O2(1g) y
131

el radical HO, para luego adicionarlos al medio de cultivo y seguir la cintica de desarrollo de la cepa B. Debido a la toxicidad de la NaN3 y el alcohol furfurlico, debieron utilizarse otros desactivadores para estas ROS. Kohn y Nelson [Kohn y Nelson, 2007] y Curtis y col. [Curtis y col., 1992] emplearon al aminocido histidina (His) en concentraciones 10 mM para desactivar al O2(1g). En esas concentraciones, la His es capaz de desactivar tambin al radical OH, (kq = 4.8
109 M-1 s-1 [Goldstone y col., 2002]). En la Figura 6.7 se muestran los cambios en el espectro de

absorcin de soluciones de AHA o Ext. S fotolizadas en presencia de 20 mM de His. Se observa que el AHA no muestra cambios espectrales apreciables, mientras que el Ext. S presenta cambios significativos en su espectro por la fotlisis, principalmente en la zona de 200 a 300 nm. Esto indica que el Ext. S posee otros compuestos adems de las SH o SH de naturaleza qumica diferente al AHA, y que estos son capaces de degradarse por vas en los que no intervienen ni el O2(1g), ni el HO.

0.6

0.4

A
0.2 0.0 200 400 600 800

/ nm
Figura 6.7: A vs para soluciones de AHA (lnea roja) o Ext. S (lnea azul) fotolizadas en

presencia de His 20 mM, respecto a las no fotolizadas. En los experimentos microbiolgicos con la cepa B, se observa que el agregado de 20 mM de His al medio R2 no afecta mayormente su desarrollo (recuadro de la Figura 6.8 y Tabla 6.3). Se realizaron ensayos con la cepa B de P. sp. Con el agregado de Ext. S o AHA fotolizados en presencia de 20 mM His, cuyos resultados se muestran en la Figura 6.8 y Tabla 6.3. Como se discuti previamente, en estas condiciones las concentraciones en estado estacionario de O2(1g) y HO son despreciables. Para el AHA, no se observaron cambios en los espectros de absorcin UV-

132

visible (Figura 6.7, lnea roja), como tampoco en los espectros FTIR o de fluorescencia. Cuando se fotoliza el AHA en presencia de His y se agrega al medio R2, no se observa mayor desarrollo de la cepa B como puede verse en la Figura 6.8 y la Tabla 6.3. Esto indica que la His disminuye la disponibilidad del sustrato para las bacterias. Mientras que el Ext. S fotolizado en presencia de His presenta cambios en sus espectros de absorcin, de fluorescencia y FTIR. La MEEF muestra un aumento en la zona de exc < 250 nm y em < 350 nm, asignada a productos de bajo peso molecular, como se ve en la Figura 6.9. Cuando se emplea el Ext. S fotolizado en presencia de His, a diferencia del comportamiento del AHA, no se inhibe su biodisponibilidad para la cepa B sino que, por el contrario, aumenta, como se observa al comparar los rombos azul y rojo de la Figura 6.8..

2.5

Atenuancia

600nm

2.0

1.5 Atenuancia600nm
1

1.0

0.5

0 0 100 200

0.0 0 200 400 600 800 1000

t /min 1200

300

400

1400

1600

t /min
Figura 6.8: Cintica de desarrollo de la cepa B de P. sp. en medio R2 + His fotolizada () R2 +

His + Ext. S (), R2 + His y Ext. S fotolizados (), R2 + His + AHA (), R2 + His y AHA fotolizados (). Las lneas slidas corresponden al ajuste de los datos con la ecuacin de Gompertz (Ec. 2.9). Recuadro: Cintica de desarrollo de la cepa B de P. sp. en medio R2 () y en R2 + His () Cabe destacar que la esterilizacin del Ext. S fotolizado en presencia de His se realiz por filtracin (tamao de poro 0.22 m). La esterilizacin por autoclave produjo caramelizacin de la solucin por modificacin no enzimtica de protenas. Esto se debe a que la fotlisis del extracto

133

genera molculas ms pequeas (cidos grasos pequeos, aldehdos, aminocidos y sacridos [Dahln y col., 1996; Tarr y col., 2001; Schmitt-Koplin y col., 1998]). La caramelizacin no se observ en el Ext. S en ausencia de His (fotolizado o no), ni en el AHA en ningn caso. Esto indica que la fotodegradacin del Ext. S tiene lugar incluso durante la irradiacin en presencia de His, un desactivador eficiente de O2(1g) y HO, lo que confirma los resultados microbiolgicos y espectroscpicos.

550 500 450

exc

400 350 300 250 200 300

350

400

450

500

550

600

em
Figura 6.9: MEEF de la solucin Ext. S fotolizado en presencia de 20 mM de His, ajustada a A550

= 0.050 y pH 7.0 Las lneas corresponden al Raman de primer y segundo orden.

Conclusiones:
Los experimentos fotoqumicos con AHA a exc > 320 nm mostraron su fotodegradacin por O2 (1g), O2, y HO, y un efecto inhibitorio por la presencia de desactivadores especficos para estas ROS durante la irradiacin. Este sustrato es un buen suplemento para el desarrollo de la cepa B de Pseudomonas sp. en medio R2, y su fotodegradacin aumenta el crecimiento microbiano. Sin embargo, el crecimiento de la cepa de referencia de E. coli no fue afectado por la adicin del AHA, irradiado o no irradiado, al medio de cultivo. Por otro lado, la irradiacin del Ext. S con luz de exc > 320 nm produce su fotodegradacin, incluso en presencia de His, un desactivador de O2(1g) y HO. Esto pudo observarse por los cambios en el espectro de absorcin UV-visible, en las MEEF, en el espectro IR y por la caramelizacin de la solucin durante la esterilizacin por autoclave. El Ext. S es un buen

134

suplemento para el desarrollo de E. coli y la cepa B de Pseudomonas sp. en medio R2, y su fotodegradacin incluso en presencia de His aumenta el crecimiento bacteriano. Las diferencias en los resultados observados con los distintos sustratos pueden explicarse por las distintas capacidades metablicas que presentan ambas bacterias. E. coli se adapta fcilmente a medios ricos en nutrientes (copiotrfico), donde pueden desarrollarse a su mxima velocidad de crecimiento [Kovrov-Kovar y Egli, 1998]. Cuando estas bacterias se inoculan en medios mnimos, necesitan adaptarse a las condiciones de deficiencia de nutrientes (oligotrfico). Para la cepa de E. coli ATCC 4352 el medio R2 es oligotrfico y el suplemento del Ext. S, fotolizado o no, constituye una fuente de carbono y energa disponible para el desarrollo de estas bacterias heterotrficas. Sin embargo, la velocidad mxima de desarrollo y la concentracin mxima de biomasa para esta bacteria son menores a las obtenidas con la cepa B de Pseudomonas
sp.. El gnero Pseudomonas, aislado frecuentemente de ambientes naturales como suelos y

sedimentos, se caracteriza por su mayor versatilidad catablica y su capacidad para crecer en medios oligotrficos [Meyer y col., 2004]. Esto se evidenci cuando la cepa B se inocul en medio R2 con diferentes suplementos. Las bacterias crecieron a velocidades mximas similares, pero alcanzaron valores diferentes de concentracin de biomasa mxima cuando se agreg al medio Ext. S fotolizado (en presencia o ausencia de His). Estos experimentos nos permiten demostrar que la fotodegradacin de los compuestos solubles del suelo genera sustratos disponibles para bacterias aisladas del mismo suelo. Se concluye adems que las vas de degradacin por O2(1g) y el radical HO no son las nicas que intervienen en la fotodegradacin y el aumento en la biodisponibilidad del extracto.

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Conclusiones Generales

Los resultados de flash-fotlisis indican que esta es una tcnica apropiada para investigar la formacin de radicales libres y la fotosensibilizacin por sustancias hmicas, como mtodo alternativo para el tratamiento de contaminantes. Se observ un alto contenido de sustancias hmicas en las dos fuentes naturales utilizadas (el vermicompost y el suelo superficial). Las mismas mostraron caractersticas fisicoqumicas similares a las SH comerciales, en particular sus propiedades espectroscpicas. El mecanismo propuesto para la reaccin del radical sulfato con las SH implica la competencia de los contaminantes y las SH por los radicales oxidantes durante los tratamientos ISCO. En las condiciones experimentales utilizadas, la cantidad de radical asociado SO4(SH) es despreciable respecto de la del radical sulfato libre, SO4. La concentracin de materia orgnica en las aguas naturales es mucho mayor a la empleada en este trabajo, por lo que el efecto espera sea ms importante en sistemas naturales. En concentraciones mayores a 7.4 g L-1 [Guetzloff y Rice, 1994] se espera que las sustancias hmicas formen micelas y los radicales se adsorban a estas por la afinidad mostrada en este trabajo. Los experimentos en presencia de peroxodisulfato, cido hmico y fenol muestran que el fenol reacciona con velocidades similares con el SO4 y el SO4(SH). La fraccin de radicales sulfato libres que reaccionan con fenol, ( (SO4)-1 - o (SO4)-1) / o (SO4)-1, es mayor que la fraccin que lo hace con el radical asociado ( (SO4(SH))-1 - o (SO4(SH))-1) / o (SO4(SH))-1. Lo que reduce, al menos con fenol como modelo de contaminante, la eficiencia del tratamiento oxidativo en presencia de SH. Los resultados experimentales y los clculos mediante la teora del funcional de la densidad (DFT) confirman el mecanismo propuesto para la reaccin del cido glico y el ion galato con el radical SO4. Se postula la formacin de radicales fenoxilo como intermediarios de reaccin. Los clculos tericos apoyan la formacin de quinonas y bifenilos sustituidos por recombinacin de los radicales orgnicos. No puede extrapolarse la qumica de

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los fenoxilos del cido glico a la de los fenoxilos generados por oxidacin de las sustancias hmicas. Adems, dada la diferencia cintica encontrada entre las reacciones del radical sulfato con cido glico y SH, el cido glico no es un buen modelo de las SH. La reaccin entre el radical sulfato y los iones cloruro disminuye el tiempo de vida de dicho radical y adems genera radicales Cl. y Cl2, agentes clorantes muy reactivos frente a los contaminantes y las sustancias hmicas. Esto disminuye la eficacia del tratamiento y produce especies halogenadas no deseadas. [Alegre y col., 2000; Malcolm y MacCarthy, 1986]. Se observa adems que los radicales de cloro no muestran el mismo comportamiento que el radical sulfato con la concentracin de sustancias hmicas. El radical Cl, el que es muy reactivo, posee un camino libre medio muy corto como para posibilitar un proceso reversible entre dos entornos diferentes. Mientras que el Cl2 decae principalmente por recombinacin y no se observan otros procesos como la compartimentalizacin en dos entornos distintos. La fotodegradacin directa del clomazone por luz solar es un proceso de menor importancia, como se observ para otros pesticidas o herbicidas [Burrows y col., 2002], lo que aumenta su permanencia en el medio ambiente. En suelos y aguas naturales con sustancias hmicas, la degradacin fotosensibilizada de clomazone puede ser un mecanismo eficiente para su remocin. Este es eficientemente degradado por procesos avanzados de oxidacin (AOP) como la irradiacin directa con luz UV o por tratamientos qumicos in situ (ISCO) con Na2S2O8, que involucra la reaccin del radical SO4.- con el contaminante, y en aguas naturales por oxidacin con oxgeno singulete, O2 (1g). El cido tricloroactico (ATCA) se degrada eficientemente mediante radicales reductores. Los radicales CO2 y CH2OH son ms eficientes que el radical anin superxido en la degradacin reductiva del contaminante, pero menos que el electrn hidratado (k(eaq. +ATCA) = 8.5109 M-1 s-1 [Ross y col.,

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1998]). Se propone para estos radicales (CO2 y CH2OH) un mecanismo de reaccin comn que genera al radical CCl2CO2 y Cl, similar al propuesto para la dehalogenacin reductiva por el electrn hidratado [Hart y Anbar, 1970]. Este radical se degrada posteriormente por reacciones trmicas hasta la completa mineralizacin del ATCA a CO2 y Cl. Se observ que el oxgeno molecular compite con en ATCA por los radicales CO2 y CH2OH. Sin embargo, en ensayos de irradiacin continua en reactores cerrados, se consume rpidamente el oxgeno disuelto inicialmente por reaccin con estos radicales hasta que se favorezca la reaccin de los radicales con el ATCA. La tendencia observada en las constantes de velocidad de reaccin observada es similar a la de los potenciales de oxidacin del radical respectivo. Estas observaciones estn de acuerdo con el mecanismo de reaccin planteado. El potencial de reduccin para el ATCA es mayor al reportado para el radical O2, por lo que es de esperarse que el O2 reaccione por un mecanismo de reaccin diferente con el ATCA que los otros radicales. Los procesos empleados para degradar al cido tricloroactico mostraron ser muy eficientes, a la vez que son econmicos y no generan residuos txicos luego de su empleo. Mientras que la fotosensibilizacin por sustancias hmicas resulto de baja eficiencia, y adems no lleva a la liberacin del cloro orgnico como cloruro, sino que genera otros productos clorados. Se observ la fotodegradacin con exc > 320 nm del AHA por O2 (1g), O2, y HO, y su inhibicin por desactivadores especficos para estas ROS. Este sustrato es un buen suplemento para el desarrollo de la cepa B de Pseudomonas sp. en medio R2, y su fotodegradacin aumenta el crecimiento microbiano. Sin embargo, el crecimiento de la cepa de referencia de E. coli no fue afectado por la adicin del AHA, irradiado o no irradiado, al medio de cultivo. Por otro lado, la irradiacin del Ext. S con luz de exc > 320 nm produce su fotodegradacin, incluso en presencia de His, un desactivador de O2(1g) y HO. Esto pudo observarse por los cambios en el espectro de absorcin UVvisible, en las MEEF, en el espectro IR y por la caramelizacin de la solucin

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durante la esterilizacin por autoclave. El Ext. S es un buen suplemento para el desarrollo de E. coli y la cepa B de Pseudomonas sp. en medio R2, y su fotodegradacin incluso en presencia de His aumenta el crecimiento bacteriano. Las diferencias en los resultados observados con los distintos sustratos pueden explicarse por las distintas capacidades metablicas que presentan ambas bacterias. El gnero Pseudomonas, aislado frecuentemente de ambientes naturales como suelos y sedimentos, se caracteriza por su mayor versatilidad catablica y su capacidad para crecer en medios oligotrficos [Meyer y col., 2004]. Estos experimentos nos permiten demostrar que la fotodegradacin de los compuestos solubles del suelo genera sustratos disponibles para bacterias aisladas del mismo suelo. Se concluye adems que las vas de degradacin por O2(1g) y el radical HO no son las nicas que intervienen en la fotodegradacin y el aumento en la biodisponibilidad del extracto.

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