MANUAL MICRODIAGNOSTICA

SEGUNDA PARTE

DIAGNOSTICO DE HONGOS Y LEVADURAS

ndice:

Diagnstico Clnico de las Micosis Micosis Superficiales Micosis Profundas Diagnstico Clnico Obtencin de Muestras Transporte Manejo Procesamiento de las Muestras Muestras ms comunes, etiologa ms probable, recogida y transporte Examen Directo Agentes etiolgicos de micosis superficiales cutneas y mucocutneas Clasificacin de Medios de Cultivo Eleccin de medios de Cultivo Identificacin Otros Medios Diagnsticos Complementarios Pruebas de Sensibilidad Bibliografa

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DIAGNOSTICO CLINICO DE LAS MICOSIS

Durante la ltima dcada se ha observado un incremento de las enfermedades micticas, sobre todo las de tipo oportunista, ello ha significado la aparicin de nuevas formas clnicas de micosis as como localizaciones o presentaciones no habituales, adems de la presencia de nuevas especies fngicas consideradas antiguamente como no patgenas pero que excepcionalmente producan enfermedad en individuos inmunodeprimidos. Diversos factores han permitido la aparicin de infecciones emergentes: cambios poblacionales y sus patrones de costumbres, avances tecnolgicos y desarrollo econmico de algunos pases, que ha permitido la generalizacin de tratamientos mdicos quirrgicos invasivos, con supervivencia de enfermos que difcilmente superaban procesos patolgicos y que favorecen el desarrollo de micosis sistmicas; incremento de viajes inter y transcontinentales, nuevos mecanismos de adaptacin de algunos microorganismos que conlleva a la aparicin de resistencia a los antifngicos e infeccin por VIH. Actualmente se reconocen entre 300 y 400 especies de hongos causantes de micosis sistmicas, las cuales constituyen un pequeo porcentaje del total de ms de 100 000 especies catalogadas. Por todo ello se prefiere mencionar un comportamiento oportunista por parte del hongo, debido a que los patgenos primarios al infectar a individuos inmunosuprimidos, se comportan con mayor agresividad, originando infecciones sistmicas, diseminadas, de evolucin aguda y mal pronstico. En este tipo de micosis es necesario considerar al binomio husped parsito. Las infecciones oportunistas se producen cuando los mecanismos de defensa especficos e inespecficos del husped son ineficaces, mientras que las sistmicas o diseminadas se producen cuando fallan los mecanismos celulares de defensa en los neutrfilos. La mayora de las micosis oportunistas siguen siendo ocasionadas por las especies clsicas: Candida albicans,Aspergillus fumigatus, Cryptococcus neoformans. Sin embargo, por las razones expuestas anteriormente han emergido nuevos hongos oportunistas Durante las ltimas dcadas, el aumento en la prevalencia de las infecciones fngicas ha sido constante, relacionado fundamentalmente con el incremento de pacientes inmunocomprometidos y con el uso generalizado de antimicrobianos, la utilizacin de inmunosupresores, maniobras diagnsticas invasoras y la implantacin de alimentacin parenteral. Junto a estas micosis invasoras, que podramos llamar oportunistas, coexisten otras micosis, que podramos considerar primarias, causadas por hongos muy adaptados para la supervivencia en los tejidos infectados. Algunas de ellas se comportan como micosis profundas, y se caracterizan porque se distribuyen en determinadas zonas geogrficas, donde resultan endmicas. Otras, ubicuas, se caracterizan por afectar a piel y mucosas: se trata de las dermatomicosis y candidosis de las mucosas. Con menos frecuencia, se encuentran las micosis subcutneas, caracterizadas por la agresividad local y poca tendencia a la diseminacin a distancia, y que suelen contar con antecedentes traumticos que justifican la inoculacin del hongo. El cultivo sigue siendo el "gold standard" del diagnstico microbiolgico, ya que permite la identificacin del agente etiolgico y la realizacin del estudio de sensibilidad. Sin embargo, no est exento de inconvenientes: la necesidad de obtener muestras por mtodos invasores, la posible contaminacin de la muestra, su dificultad para diferenciar fcilmente entre infeccin y colonizacin, la baja sensibilidad que presenta y su lentitud para el diagnstico. Las pruebas de sensibilidad a los antifngicos estn basadas en las tcnicas de microdilucin en caldo, que se desarrollaron para conocer la actividad in vitro de los antibacterianos. Estas tcnicas determinan la CMI (concentracin mnima inhibitoria), que se obtiene calculando porcentajes de inhibicin respecto a un control de crecimiento. Los estndares incluyen recomendaciones para la conservacin, la preparacin y la interpretacin de las pruebas, as como un sistema para controlar la calidad de los resultados. La introduccin de estas tcnicas produjo un cambio cualitativo en los
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MICOSIS SUPERFICIALES
1. COSMTICAS. Son las que afectan la capa crnea de la piel y la porcin suprafolicular del cabello y vellos, generalmente asintomticas por la poca o nula respuesta inmune. a) Pitiriasis versicolor. Producida por especies del hongo lipofilico Malassezia: M.furfur, M. globosa, M. obtusa, M. restricta, M. slooffiae, M. sympodiales, hongo que puede ser colonizante de la epidermis; se relaciona con la presencia de ciertos aminocidos y compuestos hidrfobos en la piel, as como la disminucin del recambio epitelial del estrato crneo. El cuadro clnico se manifiesta por la presencia de lesiones maculares hiper o hipopigmentadas en la piel del trax, parte superior de la espalda y brazos. Las especies del hongo Malassezia pueden estar involucradas en otros cuadros clnicos como la dermatitis seborreica, foliculitis en pacientes inmunocomprometidos, fungemia en lactantes prematuros en nutricin parenteral con emulsiones lipdicas y sndrome de Gougerot-Carteaud, que es una papilomatosis en regin intermamaria, interescapular, cuello y abdomen. b) Tia negra palmar. Infeccin crnica del estrato crneo causada por el hongo levaduriforme dematiaceo Phaeoannelomyces wernekii, que consiste en lesiones maculares color oscuro afectando principalmente las palmas de las manos y las plantas de los pies, rara vez en la cara. c) Piedra negra. Son ndulos duros, negros, adheridos a la porcin extrafolicular del cabello, producida por la forma sexual del hongo Piedraia hortae. d) Piedra blanca. Son ndulos blandos de color blanquecino que se pueden localizar en vellos de cejas, bigote o pelo escrotal y vulva, al igual que en cabello de la cabeza. Es producida por colonizacin de especies del hongo levaduriforme Trichosporum: T. asteroides, T. beigelii/cutaneum, T. inkin, T. mucoides, T. ovoides, T. pullulans. Este hongo tambin se ha asociado a fungemia en pacientes inmunosuprimidos, especialmente VIH positivos. 2. CUTNEAS. Se refiere a una diversidad de cuadros clnicos en los que estn involucrados la piel y sus anexos. Las manifestaciones en piel son prurito, eritema y descamacin; en cuero cabelludo son alopecia e invasin al cabello tipo endothrix, ectrothrix y tipo fvico; y en uas, onicomicosis. a)Dermatofitosis. Producida por un grupo de hongos queratinolticos identificados como dermatofitos: Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton. Sus cuadros clnicos se denominan tias y se encuentran entre las infecciones ms prevalentes a nivel mundial, principalmente en pases en desarrollo. Las Tias del cuero cabelludo son: Tia capitis no inflamatoria, tia capitis inflamatoria, con formacin de queriom de celso y tia fvica. Las otras, dependiendo del lugar del cuerpo comprometido son: Tia barbae, Tia crporis, Tia manum, Tia ungium u onicomicosis, Tia cruris y Tia pedis. Estos hongos se han clasificado segn su hbitat en antropoflicos, zooflicos y geofsicos. Los propgulos infectantes son los artroconidios, que son adquiridos por contacto directo, se adhieren especialmente a los corneocitos (no a clulas endoteliales), germinan y penetran al estrato corneo formando ramificaciones de hifas; la invasin es favorecida por las condiciones especficas de este hbitat: clulas muertas, temperatura inferior a 37C, humedad adecuada y aporte suficiente de hierro y otros nutrientes. Los dermatofitos tienen potentes queratinasas capaces de desdoblar en el pelo la queratina rica en cisteina, y la metionina en la piel; estas diferencias podran explicar el tropismo de algunas especies por ciertos tejidos. b)Dermatomicosis. Son infecciones crnicas que afectan la piel altamente queratinizadas de palmas, plantas, uas y espacios interdigitales. Los cuadros clnicos son muy similares a las tias producidas por dermatofitos, pero el tratamiento es diferente. Dentro de los principales agentes etiolgicos estn los hongos hialinos como el Scytalidium dimidiatum, S. hyalinum, Fusarium sp, Aspergillus spp, especies de Cndida y hongos negros como especies del gnero Phialophora, Curvularia, Alternaria, Bipolares, etc.
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MICOSIS PROFUNDAS
1. SUBCUTANEAS. Son infecciones del tejido celular subcutneo, adquiridas por trauma con material contaminado por hongos saprofitos ambientales. Afectan la dermis y epidermis y las manifestaciones clnicas son crnicas; se pueden caracterizar por ser inflamatorias y granulomatosas. a)Esporotricosis. El hongo que la produce se denomina Sporothrix schenkii. Despus de un perodo de incubacin de 15 a 30 das (se ha reportado hasta 2 aos) se produce una lesin nodular, denominada chancro, en el tejido cutneo y subcutneo en el sitio de inoculacin. Clnicamente se pueden producir diferentes cuadros como la esporotricosis linfocutanea, que compromete vasos linfticos drenantes; la fija o dermoepidrmica, con lesin nica y sin compromiso de vasos linfticos; la pulmonar primaria, que se observa en pacientes inmunosuprimidos, se adquiere por inhalacin y simula una tuberculosis cavitaria; la pulmonar metastsica; la osteoarticular, forma diseminada en huesos y articulaciones; la esporotricosis invasiva generalizada, que es rara; y se han descrito casos de formas menngeas y oculares en pacientes inmunosuprimidos. b) Cromoblastomicosis. Micosis producida por un grupo de hongos dematiaceos, tales como Fonsecae pedrosoi, Fonsecae compactum, Phialophora verrucosa, Cladosporum carrionii y Rhinocladiella aquasperma. Las lesiones son crnicas, de meses a aos, y en las muestras clnicas (raspado de puntos negros y biopsias) se observan las clulas esclerticas de medlar o clulas fumagoides que son patognomnicas de esta entidad. c) Lobomicosis. Producida por el hongo Loboa loboi, con lesiones crnicas tipo queloides en sitios anatmicos expuestos, como por ejemplo la regin sacra, miembros inferiores, superiores y regin auricular. d) Rinosporidiasis. El agente etiolgico no es un hongo, es un microorganismo acutico perteneciente al reino Stromophila denominado Rhinosporidium seeberii. La rinosporidiosis se caracteriza por la formacin de lesiones polipoides, pedunculadas y papilomatosas que obstruyen los conductos areos, la nasofaringe, laringe y conjuntivas. e) Eumicetomas. Infeccin de carcter crnico que se adquiere por trauma con material contaminado por hongos como Madurella mycetomatis y Exophiala sp. El cuadro clnico se caracteriza por fistulizacin, edemas y grnulos de azufre. f) Faeohifomicosis. Infeccin por inoculacin traumtica de hongos dematiaceos, como por ejemplo Alternaria alternata, Bipolaris spicifera, Curvularia geniculata, Exophiala jeanselmei, Exophiala moniliae, Wangiella dermatitidis. En las lesiones se observan hifas pigmentadas y no clulas esclerticas. Estos hongos tambin pueden causar infeccin cutnea y sistmica. g) Hialohifomicosis. Infeccin por inoculacin traumtica de hongos hialinos a nivel subcutneo, pero tambin puede cursar con compromiso sistmico. Los pacientes inmunocomprometidos los pueden adquirir por va area, por ejemplo infeccin por Fusarium spp, y Aspergillus spp. 2. SISTMICAS. Este tipo de micosis se adquieren por inhalacin de propgulos de los hongos que estn en el medio ambiente, muchas veces en nichos ecolgicos muy restringidos. Causan cuadros clnicos que dependen del estado inmunolgico del husped y de la cantidad de propgulos inhalados, y pueden ser desde cuadros asintomticos inespecficos, hasta procesos pulmonares granulomatosos; en pacientes inmunocomprometidos se manifiesta de forma generalizada. a) Histoplasmosis. Es producida por el hongo Histoplasma capsulatum variedad capsulatum, quien predomina en Amrica, desde el sur de Canad hasta Argentina, y la variedad duboisii en el frica; su nicho son cuevas de murcilagos, gallineros y palomares. Dentro de las formas clnicas tenemos la presentacin aguda y crnica, la pulmonar (asintomtica, leve, moderada, grave, neumnica o cavitada), la diseminada, de leve a progresiva, y la mucocutnea.
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b) Blastomicosis. Infeccin causada por Blastomyces dermatitidis, cuyo nicho ecolgico es el suelo de gallineros, corrales y establos, terrenos con alto contenido orgnico, abonados o con deyecciones de animales, ph cido y elevada humedad. La infeccin es crnica, con lesiones granulomatosas y supurativas; la ms frecuente es la pulmonar (aguda o crnica), pero tambin se presenta la forma extrapulmonar crnica con afeccin de piel, huesos y tracto genitourinario, la forma aguda fulminante y las formas asintomticas. c) Coccidioidomicosis. Infeccin causada por Coccidioides inmitis en zonas endmicas desde el sudoeste estadounidense, Centro Amrica, Venezuela, Paraguay hasta la Patagonia en Argentina. La inhalacin de artroconidios puede causar un cuadro pulmonar con o sin diseminacin sistmica (sea, menngea y cutnea) principalmente en pacientes inmunocomprometidos. d) Paracoccidioidomicosis. Micosis granulomatosa producida por el hongo dimrfico Paracoccidioides brasiliensis, restringido a zonas boscosas de los grandes ros y lagos del Brasil, Venezuela, Colombia, Paraguay y norte de Argentina. La infeccin puede ser asintomtica o sintomtica, como la forma juvenil aguda, con compromiso pulmonar y del sistema reticuloendotelial, con adenopatas, hepatomegalia y afeccin sea, o como la forma crnica del adulto con lesiones pulmonares y metstasis a diversos rganos, y lesiones en mucosa orofarngea y ulcero-vegetativas peribucales. e) Criptococosis. Infeccin subaguda o crnica pulmonar o menngea causada por Cryptococcus neoformans, hongo ubicuo en la naturaleza principalmente en excretas de palomas (variedad neoformans y grubii) y detritus de rboles (variedad gatti). Las levaduras desecadas y de menor tamao son inhaladas, llegan a espacios alveolares, pero el desarrollo de la enfermedad depende de la respuesta del sistema inmune celular. Aunque el foco primario es el pulmn, el tropismo por el Sistema Nervioso Central (SNC) puede llevar a diseminacin a meninges; en pacientes inmunosuprimidos puede haber presentacin clnica mucocutanea que corresponde a metstasis de la forma diseminada. 3. OPORTUNISTAS. Este tipo de micosis involucra especies de hongos que forman parte de la microflora ambiental o son comensales de la piel y mucosa, y quienes habitualmente son eliminadas por el sistema inmune celular. Cuando hay deficiencia de la respuesta inmune, alteraciones de la flora bacteriana por suministro de antibiticos o la existencia de enfermedades de base en el paciente, como por ejemplo la diabetes o enfermedades mieloproloferativas con neutropenia, pueden causar una infeccin diseminada fatal para el paciente. a) Candidiasis sistmica. Es la micosis ms frecuente. Es producida por Cndida albicans y otras especies del mismo gnero, capaces de invadir sangre y otros rganos profundos. Las levaduras de Cndida son colonizadoras de la mucosa rectal, vaginal y bucal, por lo que las infecciones pueden ser endgenas; tambin se ha demostrado la transmisin interpersonal o como resultado de contaminacin con sondas y catteres. b) Aspergilosis sistmica. Es producida por especies del gnero Aspergillus. Aspergillus fumigatus es el agente causal de ms del 90% de los casos de aspergilosis invasora; se adquiere por inhalacin de conidios, que germinan e invaden los tejidos. Los pacientes con neutropenia prolongada. Conforman el principal grupo de pacientes con riesgo para adquirir esta grave infeccin, al igual que pacientes leucmicos y receptores de rganos, los cuales pueden sufrir aspergilosis pulmonar invasora o aspergilosis sistmica con compromiso del SNC, infarto cerebral, vasculitis o abscesos cerebrales. c) Zigomicosis. Infecciones causadas por hongos pertenecientes a los mucorales: Mucor spp, Rhizomucors spp, Rhizopus spp, Cunninhanella spp, etc. Su hbitat es la materia orgnica en descomposicin. Causan cuadros principalmente subcutneos, pero formas sistmicas han sido tambin descritas, siendo la ms frecuente la rinocerebral; tambin se puede presentar a nivel pulmonar, cutneo, intestinal, en SNC, periorbitaria y nasal. d) Pneumocistosis. Neumona causada por el hongo Pneumocystis jiroveci y que afecta pacientes inmunocomprometidos, principalmente VIH positivos.
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DIAGNOSTICO CLINICO
La clnica solo provee un diagnstico presuntivo:
Las lesiones de consulta ambulatoria frecuente caracterizadas por prurito y eritema pueden sugerir micosis superficiales cutneas, mas sin embargo otras enfermedades pueden presentar cuadros clnicos similares. Adicionalmente, el uso de corticoides tpicos en lesiones de este tipo pueden generar cuadros atpicos de difcil diagnstico clnico. Las micosis de rganos profundos son cada vez ms frecuentes en la prctica clnica, afectando especialmente a sujetos con grados variables de inmunocompromiso, como en aquellos con infeccin por el VIH y enfermedades hematolgicas malignas. Las manifestaciones clnicas pueden ser inespecficas y no siempre sugerir infeccin por hongos, por lo tanto un diagnstico micolgico precoz aumenta considerablemente el xito del tratamiento. Segn un consenso entre la Organizacin Europea para el Tratamiento del Cncer, el Grupo Cooperativo de Infecciones Invasivas por Hongos de Bruselas, el Instituto Nacional de Alergias, el Grupo de Estudio de Enfermedades Infecciosas por Hongos y el Instituto Nacional de Salud de Bethesda, Maryland, se defini que para el diagnstico de las infecciones fngicas invasoras en pacientes con cncer y transplante de precursores hematopoyticos se deben considerar los factores predisponentes en el hospedero, elementos clnicos-radiolgicos y hallazgos del laboratorio. Estos factores considerados conjuntamente permitiran clasificar estas infecciones como demostradas, probables o posibles. a) Infeccin demostrada: Es suficiente el hallazgo de hongos en sangre o en sitio normalmente estril con un cultivo o examen directo, independiente de la presencia de factores predisponentes en el husped o elementos clnicoradiolgicos. b) Infeccin probable: Es aquella en que existen factores predisponentes en el husped, elementos clnicos sugerentes y un estudio micolgico positivo, pero no definitorio, como podra ser una serologa de galactomanan positiva o un cultivo positivo de sitio no estril.

b)

c) Infeccin posible: Es aquella en que alguno de los tres elementos no esta presente, ya sean los factores predisponentes, los elementos clnico-radiolgicos o la micologa.

Papel del laboratorio en el diagnstico de las micosis

Los procedimientos del laboratorio son de gran utilidad para los mdicos ya que confirman un diagnstico presuntivo. Establece el agente etiolgico. Son tiles en la seleccin y monitoreo de la terapia antifngica, seguimiento evolutivo y para confirmar la curacin. Los procedimientos del laboratorio incluyen: 1. Demostracin de los hongos en los especimenes a estudiar mediante a) Microscopa ptica: -Frescos ( KOH, Tinta china). -Tinciones (Gram, Giemsa, HP) b) Cultivos (incluye identificacin hasta especie y la determinacin de la sensibilidad in vitro). 2. Deteccin de la respuesta humoral especfica en determinados hongos patgenos. 3. Deteccin de antgenos fngicos y metabolitos en fluidos corporales o tejidos mediante tcnicas serolgicas.
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Objetivo principal del laboratorio

Detectar rpida y eficazmente la presencia de los hongos en muestras clnicas y determinar si es el agente etiolgico o es un contaminante.

OBTENCION DE LAS MUESTRAS

Para alcanzar el xito en el diagnstico micolgico partiendo de una sospecha clnica, es fundamental realizar adecuadamente la recogida de la muestra a partir de la lesin, su correcta manipulacin para mantener la viabilidad del agente etiolgico y evitar posibles contaminaciones en su transporte y procesamiento, la siembra de la misma en los medios idneos y a la temperatura adecuada, as como la identificacin e interpretacin correcta de los aislamientos. nicamente con el procesamiento adecuado se puede recuperar el hongo claramente asociado con el proceso infeccioso. A la hora de valorar un crecimiento fngico hay que tener siempre presente la necesidad de diferenciar un "aislamiento significativo" de otros que no lo son, ya que no es lo mismo identificar una especie fngica que diagnosticar una micosis.

Consejos generales para optimizar la recogida de las muestras:

1. Debe disponerse de un protocolo de recogida de muestras que ser actualizado peridicamente. 2. Es responsabilidad del mdico asegurar una correcta recogida y envo en condiciones adecuadas de las muestras, funciones que no deben ser delegadas en personal no cualificado. 3. Es necesario recoger las muestras aspticamente, utilizando contenedores estriles, remitirlas al laboratorio antes de 2 horas y sembrarlas lo antes posible. 4. La muestra debe recogerse antes de instaurar el tratamiento y siempre de la parte activa de la lesin (cuando se sospecha una micosis pulmonar es preferible una muestra respiratoria que un hemocultivo). 5. Se debe evitar la utilizacin de hisopos siempre que el tipo de lesin lo permita, pues estn contaminados frecuentemente con flora bacteriana. Sin embargo, algunas muestras (conducto auditivo, faringe, vagina, crvix) no pueden ser recogidas de otra forma. 6. Las muestras de lesiones cerradas y abscesos suelen presentar un gran rendimiento. Deben aspirarse con jeringa y transferirse a un contenedor estril con solucin salina, prestando atencin a la recogida de grnulos, si los hubiese. 7. El raspado de lesiones de piel y mucosas puede realizarse con distintos materiales; los ms utilizados son bistur, moqueta o cepillo. 8. En situaciones que requieran un estudio epidemiolgico, debe establecerse la necesidad de una recogida de muestras ambientales, familiares o animales. 9. El recipiente de recogida se identificar con los datos del enfermo (nombre y localizacin), y debe protegerse para que no se rompa en su transporte al laboratorio. 10. Las muestras deben ir acompaadas obligatoriamente de la orden de peticin para Microbiologa. En el cual, al menos, debe hacerse constar la siguiente informacin: datos del paciente (nombre y apellidos, nmero de historia clnica, fecha de nacimiento y sexo); datos clnicos (orientacin diag8

nstica, tratamiento antimicrobiano, enfermedad de base y antecedentes de inters); datos del mdico solicitante. 11. Al laboratorio se le debe informar de la sospecha de presencia de hongos peligrosos. Tambin si se sospecha la presencia de hongos con requerimientos especiales, Malassezia spp, por ejemplo, as como de viajes u origen de paciente. Los envases para la recogida de las muestras pueden variar segn el tipo de muestra a recoger y transportar: - Tubos estriles con tapn de rosca: LCR y otros lquidos biolgicos. - Frascos estriles de boca ancha con tapn de rosca: orinas, esputos, heces, fragmentos de tejidos, etc. - Torulas o hisopos de algodn estriles: Se usan para tomar muestras de superficies y orificios corporales (exudados, secreciones). - Jeringas estriles: slo se admiten cuando su volumen no permita transferir la muestra a un medio de transporte adecuado. - Frascos de hemocultivo para lquidos biolgicos. - Placas de Petri estriles.

TRANSPORTE
Todas las muestras deben enviarse al laboratorio rpidamente, sin conservantes. Las muestras deben transportarse en un recipiente estril, humidificado y a prueba de vertidos; sin embargo, las muestras dermatolgicas pueden transportarse en un recipiente seco (placa de Petri, papel de fotografa negro, entre dos portas). En general, no deben introducirse en medios de transporte, a no ser que sea fcil retirar la muestra del medio. Las muestras en que se sospeche la presencia de dermatofitos u hongos dimrficos se conservarn a temperatura ambiente, nunca refrigerados. Los raspados corneales y hemocultivos deben sembrase directamente en el medio de cultivo adecuado. Si esto no fuera posible, se usarn medios de transporte adecuados o se conservaran a 4 C.

MANEJO
Todas las muestras deben manejarse como si tuvieran microorganismos potencialmente peligrosos. Cuando una muestra se recibe en el laboratorio, y antes de procesarse, debe someterse a una inspeccin previa para asegurarse que ha sido bien seleccionada, recogida y transportada. Se rechazar en los siguientes casos: a) muestra no identificada, b) transporte inadecuado o demasiado prolongado, c) muestra derramada, d) cantidad insuficiente o inadecuada. En todos estos casos se contactar con el mdico solicitante para pedir nueva muestra o solucionar el problema de la misma.

PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
Para realizar un buen diagnstico micolgico es importante que la muestra se recoja y se transporte en condiciones idneas y que no se demore su cultivo. Aunque hay pocos estudios sobre la disminucin de la viabilidad de los hongos a temperatura ambiente o por la accin del hielo seco, es conocida la dificultad de recuperar Rhizopus arrhizus en muestras en las que se demora el cultivo, y tambin, la prdida de viabilidad de algunos hongos por la desecacin, temperatura elevada (>37 C) o baja (<10 C), sobrecrecimiento bacteriano, presencia leucocitos, etc. La refrigeracin puede comprometer el aislamiento de hongos dermatofitos, Malassezia spp. e H. capsulatum. Las muestras que estn potencialmente contaminadas con flora bacteriana (muestras de piel, aspirados trans-traqueales, aspirados de odo interno, muestras de conjuntiva) deben enviarse a tempe-

ratura ambiente. En trminos generales, los procedimientos utilizados en el laboratorio de bacteriologa son adecuados para el cultivo de hongos, pero hay que tener en cuenta que, habitualmente, la carga microbiana es inferior en el caso de los hongos con respecto a las bacterias. Esto obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un rendimiento ptimo. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el facultativo debe ser informado inmediatamente. Todo laboratorio debe distribuir por escrito las normas de rechazo de muestras. Los resultados de laboratorio dependen de la toma de muestra, la cual debe hacerse antes de instituido el tratamiento o cuando ste se ha suspendido previamente (1-2 semanas, para piel o pelo; varios meses, para las uas). Las micosis superficiales estudiadas en este captulo se limitan a la piel, el pelo y las uas. Otros procesos que afectan a las capas ms superficiales de la piel son producidos por bacterias y no forman parte de esta Gua; sin embargo, el eritrasma (producido por Corynebacterium minutissimum) se ha estudiado clsicamente dentro de la Micologa Mdica y requiere habitualmente un diagnstico diferencial con las micosis superficiales Para la adecuada toma de muestra de las micosis superficiales se recomienda seguir las siguientes recomendaciones: examen con luz de Wood, limpieza del rea afectada y recogida de la muestra.

Examen con luz de Wood

Antes de realizar la toma de muestras de una micosis superficial es aconsejable examinar las lesiones de la piel (sospechosas de pitiriasis versicolor o eritrasma) y cuero cabelludo (dermatofitosis) en una habitacin completamente oscura bajo la luz de Wood (luz ultravioleta de 365 nm de longitud de onda, que pasa a travs de un filtro de cristal que contiene xido de nquel). La piel normal muestra un color azul, mientras que en infecciones bacterianas como el eritrasma, emite fluorescencia rojo coral. En micosis como la pitiriasis versicolor, las reas afectas emiten una fluorescencia brillante verdosa amarillenta (pudiendo poner de manifiesto lesiones no perceptibles a simple vista). En tinea capitis debidas a Microsporum spp. o Trichophyton schoenleinii, las lesiones muestran una fluorescencia caracterstica. El descubrimiento de Margarot y Deveze, en 1925, de que pelos infectados por ciertos dermatofitos producan una fluorescencia caracterstica bajo la luz ultravioleta de la lmpara de Wood fue un importante avance en la Micologa Mdica. La naturaleza y fuente de las sustancias fluorescentes en los pelos infectados no son del todo conocidas y la sugerencia de que era una pteridina ha sido cuestionada El pelo permanece fluorescente despus de que el hongo deje de ser viable, y el material fluorescente puede ser extrado del pelo en agua caliente o solucin fra de bromuro de sodio. Debido a que el crecimiento del hongo, en el medio de cultivo o de forma in vitro en el pelo, no origina fluorescencia, esta se atribuye a alguna sustancia producida por la interaccin entre el crecimiento del hongo y del pelo. Solamente algunos dermatofitos capaces de invadir el pelo producen fluorescencia: M. canis y M. audouinii, siempre producen fluorescencia verde; sin embargo, M. gypseum y M. nanum, lo hacen ocasionalmente.
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 T. shoenleinii, causa una fluorescencia verde plida. En reas geogrficas donde Microsporum spp. y el favus son prevalentes, la luz Wood es una herramienta esencial tanto en el diagnstico y el tratamiento del enfermo, como en el control de epidemias.Adems, la lmpara es fcilmente trasportable y puede ser usada en instituciones para el rpido examen de los contactos.

Limpieza del rea afectada

Antes de realizar la recogida de la muestra, la piel, pelos o uas afectados deben limpiarse con etanol (70%) para eliminar la flora bacteriana, exudacin o restos de excipientes de tratamientos previos que dificultan el examen directo y el cultivo

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Tabla 1. Muestras ms comunes, etiologa ms probable, recogida y transporte

Muestra Abscesos subcutneos Biopsias

Hongo probable

Recogida y transporte Aspirar con jeringa y aguja. Transporte anaerobio o inoculacin directa > 1 ml.

Tiempo y temperatura de transporte y conservacin 24 h, temperatura ambiente (TA).

Notas Muestra de la base de la lesin y pared del absceso Sospecha de zigomicetos y hongos dimrficos, procesar inmediatamente. Biopsias obtenidas por Punch: pueden utilizarse para las lesiones de piel. No estandarizado actualmente.

Levaduras, hongos filamentosos. Siempre que se sospeche micosis profunda.

Usar estrictas condiciones de < 24 h, TA. Almaceasepsia y tomar la muestra de la nar a 4 C. zona central de la lesin. Colocar la muestra en un tubo o frasco estril con suero fisiolgico estril no bacteriosttico para prevenir la desecacin.

Catter Conjuntival y exudado lacrimal

Candida spp. Malassezia spp.

5 cm. distales colocarlos en contenedor estril. Tomar la muestra con torula estril de algodn o alginato clcico, humedecida en medio de cultivo o suero fisiolgico estril, frotar la zona lesionada suavemente e introducir la torunda en el medio de transporte. Si se dispone de los medios de cultivo es preferible hacer la inoculacin directamente.

Corneal, raspado

C. albicans, C. neoformans. Hongos filamentosos muchas especies (Aspergillus spp., Fusarium spp.; Paecilomyces spp., Penicillium spp., hongos dematiceos)

Inocular directamente en el medio y en el porta, mediante raspado con esptula. Obtencin de la muestra por el oftalmlogo en quirfano; despus de raspar varias veces la crnea con un asa de Kimura o con bistur, se debe sembrar en placa Petri en X o en C clavando el asa en el agar. Otra parte de la muestra se fija en portaobjetos para el estudio anatomopatolgico Limpiar la zona con alcohol al 70%. Raspar con un bistur estril y depositar en placa de Petri estril. En el caso de que haya exudado, tomar con torula.

Se puede guardar a temperatura ambiente si se retrasa su envo al laboratorio.

Sembrar tocando con ambos lados de la esptula dibujando una C en el medio.

Espacios interdigitales

Dermatofitos

El transporte de estas muestras debe ser inmediato. Conservacin de estas muestras: a temperatura ambiente mejor que a 4C, ya que algunos dermatofitos no sobreviven a la refrigeracin.

No usar torulas, excepto cuando la lesin sea purulenta o se encuentre en zonas hmedas de la piel o en membranas mucosas. Si la toma se hace con torula, el examen directo no es vlido y el cultivo no ser todo lo ptimo que sera deseable.

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Grnulos subcutneos

Grnulo blanco: Acremonium falciforme, Acremonium recifei, Aspergillus nidulans, Neotestudina rosatii, Pseudoallesheria boydii; Grnulo negro: Exophiala jeanselmei, Leptosphaeria senegalensis, Madurella grisea, Madurella mycetomatis, Pyrenochaeta romeroi Slo se recomienda en caso de candidiasis diseminada.

Recoger pus, exudado, biopsia, < 24 h, TA. y drenaje de tractos sinuosos. Lavar los grnulos con solucin salina que contenga antibiticos.

Granos o grnulos en eumicetoma.

Heces

Si las heces son formadas, homogenizar con suero fisiolgico estril. Para el diagnstico de infecciones fngicas del tracto gastrointestinal es ms til tomar muestras de biopsia.

Transporte inmediato. Almacenamiento a 4 C.

Herida

Levaduras, miceto- Muestra aspirada de la parte mas, actinomicosis profunda y transporte en jeringa y esporotricosis sin aguja. Remitir en contenedor estril Si se utiliza hisopo, deberan remitirse varios.

Transporte inmediato.

Muestra del margen activo. Si la muestra se recoge por ciruga, remitir tambin una porcin de la pared del absceso.

Lentes de contacto:

Siempre que sea posible enviar la lente al laboratorio, si no es posible prescindir de la lente, frotar con torula la superficie de contacto corneal. Endoftalmitis y celulitis orbitaria

Almacenamiento a 4 C.

Lquido intraocular

Las muestras tienen que reco< 24 h TA. gerse por el oftalmlogo en el quirfano, mediante puncin y aspiracin del fluido. Si la muestra es muy densa se recoge con bistur y se coloca en contenedor de boca ancha estril. Tambin se recomienda inoculacin directa en los medios de cultivo y la preparacin de dos o ms preparaciones para tincin. Tras la preparacin adecuada Procesamiento inde la zona, obtener el lquido mediato. < 24h, TA. con jeringa en condiciones de Nunca refrigerar. esterilidad. Transferir a tubo estril. Recoger como para bacterias, al menos 2 ml en contenedor estril. Preparar para incisin quirrgiComo la sangre. ca. Lisis centrifugacin. Medio apropiado en la cabecera del enfermo

Si es lavado intraocular, centrifugar antes de sembrar.

Lquidos estri- Candida spp. les (LCR, pleu- H. capsulatum, C. ral, peritoneoformans neal...)

El aspirado o biopsia cerebral pueden ser necesarios

Mdula sea

Histoplasmosis, candidosis, criptococosis. (C. neoformans, H. capsulatum)

Si se usa un sistema automatizado, revisar las normas del fabricante.

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Odo externo Oral

Aspergillus niger, Aspergillus flavus Candida spp., Paracoccidioides brasiliensis

Girar con firmeza el hisopo en el <2 h, TA canal externo. <24 h, 4C Tomar con hisopo de la lesin activa; enjuagar con solucin salina para Candida. Medio de transporte para el hisopo o contenedor estril. < 24 h, TA Medio selectivo para levaduras.

Orina

Sospecha de candidosis urinaria, candidosis diseminada y criptococosis. Levaduras C. neoformans, C. immitis, H. capsulatum, B. dermatitidis. Sospecha de tia de la cabeza: Trichophyton spp. Microsporum spp. (tinea capitis)

Primera orina de la maana en < 15 min, TA contenedor estril. Orina obteni- < 24 h, 4 C da por sondaje. Orina postmasaje prosttico. Volumen necesario entre 10 y 50 ml.

Usar la orina de la parte media de la miccin. Puede utilizarse para deteccin de antgeno de Histoplasma.

Pelos

Limpiar la lesin con alcohol al 70% o con agua destilada estril. Seleccionar el rea, arrancar con pinzas al menos 10-12 pelos frgiles que estn fragmentados, o que presenten fluorescencia a la lmpara de Wood y recoger escamas. En nios con exudado puede ser til frotar con un hisopo. Desinfectar con alcohol de 70%. Raspar el borde de la lesin con un escarpelo, bistur o porta. La muestra debe tomarse de la parte perifrica de la lesin que va a ser donde van a estar los hongos en su fase proliferativa, mientras que en el centro de la lesin la mayora de estos hongos pueden ser no viables.

Contenedor seco. Si se hace con hisopo sembrar directamente. < 72 h, TA.

Depositar en una placa Petri estril. Para el transporte no usar tubos que mantengan la humedad, favorece el sobrecrecimiento bacteriano.

Piel lampia

Sospecha de infeccin por dermatofitos y candidiasis cutnea Trichophyton spp. E. floccosum Microsporum spp. Candida spp. Sporothrix schenkii

Colocar una gota de La humedad, favoagua sobre la lesin rece el sobrecrecipara evitar que las miento bacteriano. escamas "vuelen". Directamente sobre el medio o en contenedor estril o entre dos portas. < 72 h, TA.

Piel lampia, pitiriasis versicolor Respiratorias: esputo, aspirado traqueal, aspirado bronquial, lavado broncoalveolar

Malassezia spp.

Adherir cinta adhesiva (scotch) Raspar varias lesiode varias zonas de la piel para nes de la piel sobre observacin directa al microsco- placa Petri. pio. Recoger 3 esputos en 3 das consecutivos. La utilidad de esta muestra viene condicionada por su "calidad" en funcin del nmero de leucocitos polimorfonucleares e histiocitos en la muestra, Cuando sea posible lavado broncoalveolar, cepillado bronquial. Contenedor estril >1 ml. < 2 h, TA / < 24 h, 4 C Esputo de 24 h no es aceptable. Los hongos dimrficos sobreviven poco tiempo. Requieren procesamiento inmediato. Hacer las extensiones para tinciones de Gram, Giemsa.

Micosis profundas (blastomicosis, candidosis, coccidiomicosis, histoplasmosis, aspergilosis, mucormicosis...) y actinomicosis (actinomicosis, nocardiosis) de localizacin pulmonar. Levaduras, hongos filamentosos.

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Sangre

Cuando se sospecha criptococosis, candidosis, histoplasmosis diseminada y otras fungemias (Fusarium spp., Scedosporium spp., Paecilomyces spp., Aspergillus spp.). Candida spp., Malassezia spp., C. neoformans, H. capsulatum.

Desinfectar la zona con compuesto iodado. Sistemas automatizados. Medios bifsicos de infusin cerebro-corazn. Extraer la mxima cantidad de sangre recomendada.

< 24 h, TA.

La mayora de las Candida spp. se puede recuperar en los hemocultivos. Si se usa un sistema automatizado determinar qu hongos se pueden detectar. Para los hongos dimrficos: lisis centrifugacin. Puede detectarse antgeno criptoccico, de Histoplasma o Aspergillus.

Seno nasal

Recoger el contenido del seno quirrgicamente. Inocular directamente o transportar en una gasa estril hmeda. Sospecha de onicomicosis. Trichophyton spp. Epidermophyton floccosum Microsporum spp. Candida spp. Scopulariopsis brevicaulis Otros hongos filamentosos de ms difcil interpretacin. Desinfectar con alcohol 70%. Lesiones dorsales: raspar la superficie y desecharla, recoger la parte profunda. Lesiones subungueales o dstales: recoger los residuos de debajo de la ua con bistur, eliminando las primeras porciones y cortar la ua con unas tijeras estriles y posteriormente raspar con un bistur estril la parte inferior de la ua. Lesiones periungueales: tomar escamas o exudado.

< 24 h, TA.

Uas

Depositar la muestra La humedad, favoen placa Petri estril rece el sobrecrecio en tubo. miento bacteriano. < 72 h, TA.

Vaginal

C. albicans, C. gla- Como para bacterias. brata, Candida spp.

Medio de transporte. <24 h, TA o refrigerado

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EXAMEN DIRECTO
El diagnstico definitivo de la mayora de las micosis requiere el aislamiento e identificacin del hongo a partir del cultivo, lo que supone con frecuencia, varios das o semanas de dilacin. Las muestras para estudio micolgico deben examinarse tanto macroscpica como microscpicamente. El mtodo ms rpido para la deteccin de estructuras fngicas en una muestra clnica es el examen microscpico de la misma. Este examen puede aportar, en ocasiones, un diagnstico definitivo (pitiriasis versicolor) y en otras, un diagnstico de sospecha previo a la confirmacin definitiva por cultivo. Por lo tanto, es un procedimiento que debera realizarse en todos los laboratorios ya que utiliza tcnicas sencillas, permitiendo un cultivo mejor dirigido, seleccionando los medios ms apropiados. Sin embargo, si la muestra es escasa, el cultivo debe ser prioritario. Las tcnicas moleculares comienzan a ser una realidad y permitirn un diagnstico ms rpido que el cultivo, si bien estn menos desarrolladas que para las bacterias o los virus. Observacion macroscopica. Las muestras, antes de ser procesadas, tienen que observarse macroscpicamente, en busca de material caseoso, purulento, hemorrgico, necrtico o grnulos. Observacion microscopica. El examen microscpico directo de una muestra clnica correctamente tomada es el medio ms simple y rpido de detectar una infeccin fngica. Cuando los elementos fngicos estn presentes en nmero suficiente se puede establecer una orientacin diagnstica presuntiva, en ocasiones definitiva, y en pocos minutos informar al clnico, lo cual permitir la instauracin temprana de una terapia antifngica, siendo ste uno de los factores esenciales en el pronstico de las micosis en los pacientes inmunocomprometidos. La microscopa sigue siendo una de las herramientas ms antiguas y tiles del miclogo clnico. Con frecuencia los hongos tardan en desarrollar las estructuras conidigenas caractersticas para su identificacin definitiva. Por lo tanto, es de gran utilidad que a la vez que se inoculan los medios de cultivo, se realicen las tcnicas microscpicas que, en tiempo real (menos de 10 min), puedan orientar de forma preliminar la etiologa del proceso. El examen microscpico directo proporciona un diagnstico definitivo si se observan elementos fngicos patognomnicos: cpsula de Cryptococcus neoformans, clulas fumagoides en cromoblastomicosis, levaduras pequeas intracelulares de Histoplasma capsulatum, quistes/ascas tpicos de P. jiroveci, levaduras con brotes de base ancha de Blastomyces dermatitidis, levaduras con gemacin multipolar en rueda de timn de Paracoccidiodes brasiliensis o las esfrulas de Coccidiodes immitis. En algunos casos, el diagnstico microscpico puede ser la nica evidencia de infeccin fngica y, en otros, su negatividad puede sustentar la interpretacin de aislamientos como contaminantes. La escasez de la muestra es, en la prctica, la nica razn para no efectuar la observacin microscpica en beneficio del cultivo. El examen microscpico puede tambin orientar la tcnica de cultivo (medios, temperatura, tiempo de incubacin, precauciones especiales de bioseguridad) e, incluso, su inutilidad por tratarse de patgenos enigmticos no cultivables como Rhinosporidium seeberi, Lacazia loboi o Pneumocystis jiroveci. Los mtodos usados para la visualizacin fngica difieren en algunos aspectos de los de las bacterias; el mayor tamao de los hongos hace, generalmente, innecesarios la tincin de frotis secos; en su lugar son ms utilizadas las preparaciones directas en fresco con o sin lquidos de montaje y clarificacin. La observacin microscpica se realiza con bajo aumento, seguida de alto aumento en seco y, si es necesario, con aceite de inmersin. Las dos formas observadas habitualmente son
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Tabla 2: Agentes etiolgicos de micosis superficiales cutneas y mucocutneas

Tabla mostrando las caractersticas morfolgicas de las diferentes especies de hongos patgenos y su morfologa in vivo : tal como se observa la morfologa en una tincin al fresco y al directo de la muestra; In vitro: tal como se observa la morfologa de un frotis al fresco del cultivo de la misma muestra.
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Tabla 3 : Agentes etiolgicos de micosis profundas , subcutneas y sistmicas

Tabla mostrando las caractersticas morfolgicas de las diferentes especies de hongos patgenos y su morfologa in vivo : tal como se observa la morfologa en una tincin al fresco y al directo de la muestra ; In vitro: tal como se observa la morfologa de un frotis al fresco del cultivo de la misma muestra.

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levaduras y/o elementos miceliares. La mayora de los hongos se pueden detectar sin tincin, en la mayor parte de las muestras clnicas como esputos, orinas, exudados y LCR, usando siempre que sea posible microscopia de contraste de fases. No obstante, se han desarrollado una serie de tinciones (tinta china, Giemsa, argnticas, agentes quimiofluorescentes, etc.) para mejorar la sensibilidad de la tcnica. Las tcnicas microscpicas directas son de gran utilidad en el estudio de muestras clnicas de pacientes con micosis que afectan a la piel y mucosas, pero tambin son muy tiles en el diagnstico de micosis subcutneas y profundas. Son mltiples las tcnicas de observacin microscpica para el diagnstico de las micosis. Se utilizan montajes hmedos, tinciones fijas y diversas tcnicas histolgicas para las muestras de tejidos. En los montajes hmedos, la adicin de KOH y dimetil-sulfxido (DMSO) permiten la clarificacin de la muestra, mientras que la adicin de glicerol, mejora la conservacin de las estructuras fngicas. La sensibilidad de las diferentes tcnicas en montaje hmedo es semejante, aunque la observacin requiere menos experiencia en el caso de las tinciones basadas en mtodos fluorescentes. De entre las tinciones fijas e histolgicas, las tinciones argnticas y el PAS son las ms adecuadas para la observacin de estructuras fngicas. En la tabla 2 se resumen las tcnicas que se pueden utilizar. Limitaciones del examen microscpico

Un examen directo negativo nunca descarta una infeccin fngica. La sensibilidad de la tcnica puede estar entre 103-105 elementos fngicos por ml y puede depender del lugar anatmico, tipo de paciente, tincin y experiencia del observador. El examen microscpico puede originar falsos positivos al confundirse ciertas estructuras con elementos fngicos (linfocitos lisados que se confunden con C. neoformans en la tincin con tinta china, fibras de colgeno o del hisopo que se confunden con elementos fngicos, gotas de grasa con levaduras en gemacin, etc.). Estos posibles errores pueden minimizarse con un segundo examen o con la experiencia del observador. El examen microscpico debe realizarse, al menos, en todas las muestras con alta sospecha de micosis; aunque lo ideal sera realizarlo siempre que fuese posible. Posee una relativamente baja sensibilidad diagnstica. En la mayora de los casos, no es posible identificar la especie fngica. No permite la realizacin de estudios de sensibilidad a los antifngicos.
En fresco: -KOH -KOH + tinta Parker -KOH + blanco calcoflor -Tinta china (Cryptococcus) Tinciones: -KOH, KOH + tinta Parker, KOH + blanco calcoflor: uso general. -Giemsa: uso general. -PAS: uso general. -Tinciones argnticas: uso general. -Fontana Masson: Pneumocystis, dematiceos.

SELECCIN DE MEDIOS DE CULTIVO El objetivo fundamental de la utilizacin de los medios de cultivo es optimizar el crecimiento de los microorganismos. En los medios de cultivo micolgicos, los antimicrobianos se utilizan tanto para inhibir el crecimiento bacteriano como el de otros hongos ambientales.

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CLASIFICACIN
Atendiendo a su composicin, los medios de cultivo pueden ser generales, enriquecidos, selectivos, diferenciales y especiales. Generales: El ms caracterstico y clsico es el agar Sabouraud con glucosa . Se utiliza como medio de cultivo general y fundamentalmente para la realizar la descripcin de las caractersticas morfolgicas de la mayora de los hongos. Enriquecidos: Se utilizan especialmente en micosis sistmicas endmicas (histoplasmosis, blastomicosis), para la recuperacin de la fase levaduriforme. Un ejemplo de estos medios es el agar cerebrocorazn con sangre (BHI). Selectivos: Son medios que favorecen el crecimiento de los microorganismos deseados impidiendo el de otros. Los componentes ms utilizados como agentes selectivos son antibacterianos (cloranfenicol, gentamicina, penicilina, estreptomicina) y tambin inhibidores de hongos como la cicloheximida que es especialmente til en las muestras cutneas y respiratorias para el diagnstico de micosis sistmicas endmicas. Diferenciales: Se utilizan para ayudar a la identificacin del hongo basada en la apariencia de ste en dicho medio, merced a la adicin de determinados componentes como por ejemplo sustancias cromgenas, o indicadores de pH como en el DTM. Especiales: Son aquellos medios que contienen algn componente (por ejemplo, cido cafeico) destinado a aislar un agente concreto ( C. neoformans), favorecer la identificacin de ciertas especies (por ejemplo, el medio de Czapeck), u obtener estructuras de reproduccin sexual (por ejemplo, agar acetato, agar patata-zanahoria).

ELECCIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios ms utilizados en el cultivo de hongos son: agar Sabouraud glucosa (AGS), habitualmente con la modificacin de Emmons, con cloranfenicol y con/sin actidiona; agar infusin cerebro corazn (BHI) con o sin sangre de cordero al 5%, con o sin antibacterianos; y agar papa dextrosa . Sin embargo, los hongos tambin pueden crecer en medios no selectivos, incluidos la mayora de los medios bacteriolgicos, si se incuban el tiempo suficiente. La eleccin y el nmero de medios a utilizar estn condicionados por el costo, la disponibilidad y las preferencias personales, pero siempre se deben incluir medios con antibacterianos y sin ellos. La incorporacin de cicloheximida (actidiona), inhibidor de muchos hongos considerados contaminantes, ayuda especialmente en las micosis de la piel, aunque pueda inhibir algunos patgenos fngicos importantes; por ello, debe utilizarse siempre en combinacin con otro medio sin cicloheximida. Los medios de cultivo ms empleados en micologa pueden agruparse en dos categoras en funcin de su utilidad: aislamiento e identificacin. Para el aislamiento, la utilizacin de 3-4 medios prcticamente cubre todas las necesidades: AGS con/sin antimicrobianos; un medio con cicloheximida y agar infusin cerebro corazn, para las micosis sistmicas endmicas. Para la identificacin, puede ser necesario un nmero mayor de medios que depender del nmero de muestras, las etiologas ms probables en la zona geogrfica, las posibilidades del laboratorio y el nivel diagnstico esperable segn el tipo de centro. Agar Czapek Dox: se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmente Aspergillus spp. y Penicillium spp. Es el medio de referencia para la identificacin de Aspergillus spp. Agar de papa dextrosa : es un medio utilizado para la estimulacin de la formacin de conidias, en la preparacin de inculos de hongos miceliales y en la estimulacin de produccin de pigmentos: rojo en Trichosporum rubrum, rosa salmn en Microsporum audouinii y amarillo en Microsporum canis. Se utiliza con frecuencia en microcultivos para observar las caractersticas morfolgicas. Agar Dixon modificado: utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puede modificarse aadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida.

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Agar Sabouraud + Glucosa modificado por Emmons: es el medio estndar para el aislamiento, esporulacin y conservacin de muchos hongos. Su pH y la concentracin de glucosa favorecen la esporulacin. Agar infusin de cerebro corazn: puede utilizarse como medio enriquecido para facilitar el crecimiento de C. neoformans a partir de muestras estriles como el LCR y el mantenimiento de la fase levaduriforme de algunas micosis sistmicas, ya sea con sangre o sin ella. En general, est indicado para el aislamiento de una gran variedad de patgenos, incluyendo levaduras, mohos y bacterias como Nocardia. Enriquecido con sangre de carnero al 10%, se utiliza para el aislamiento de todos los hongos, incluyendo los hongos dimrficos. Pueden aadirse antibacterianos (cloranfenicol y/o gentamicina) para convertirlo en selectivo. En algunas ocasiones tambin puede completarse con cicloheximida (facilita el aislamiento de Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis). Agar inhibidor de mohos: es un medio enriquecido que contiene cloranfenicol o gentamicina, pero no actidiona. Se utiliza en el aislamiento de hongos sensibles a la cicloheximida ( Cryptococcus, zigomicetos, etc.) a partir de muestras contaminadas. Permite el desarrollo de la mayora de los mohos y de las levaduras. Agar Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol: es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de hongos patgenos a partir de muestras muy contaminadas con hongos saprofitos y bacterias. Se utiliza fundamentalmente en el aislamiento de dermatofitos y hongos dimrficos. Inhibe algunas especies de hongos de inters mdico ( Candida no albicans, Aspergillus, zigomicetos, C. neoformans, etc.). Agar urea de Christensen: se utiliza en la identificacin de algunos dermatofitos, especialmente Trichophyton rubrum de Trichophyton mentagrophytes y de algunas levaduras ( C. neoformans). Medios cromognicos para levaduras: Cromocandida contienen diversos sustratos enzimticos que estn unidos a compuestos cromognicos. Muy til para el estudio de levaduras. Dermatophyte test medium: medio utilizado para el aislamiento de dermatofitos en muestras muy contaminadas, proporcionando una identificacin presuntiva. Los dermatofitos producen alcalinizacin, virando el medio de amarillo a rojo. Algunas bacterias y algunos hongos tambin pueden producir alcalinizacin. Debido a que se trata de un medio coloreado, no es un medio til para la caracterizacin de los pigmentos producidos por los dermatofitos. La cicloheximida inhibe muchos de los hongos saprofitos. Agar harina de maz con/sin Tween 80: se utiliza en el cultivo y diferenciacin de especies de Candida basndose en las caractersticas miceliales. El Tween 80 se incorpora para demostrar la formacin de clamidoconidias. Si se le aaden 10 g de glucosa puede utilizarse en la diferenciacin de T. rubrum y T. mentagrophytes basndose en la produccin de pigmento. Agar Lactrimel : Medio conteniendo leche, harina de trigo, y miel. Adems contiene inhibidores lo que impiude el desarrollo de Bacterias :(E.Coli y cocceas : S.aureus)

INCUBACIN
La temperatura ptima de crecimiento de la mayora de los hongos patgenos es 30 C. Sin embargo, Sporothrix schenckii es una excepcin, crece ms rpido a 2728 C. Hay laboratorios que utilizan la temperatura ambiente en lugar de 30C, pero no es recomendable, ya que los cambios de temperatura son notables entre el da y la noche en la mayora de los laboratorios. La temperatura de 37C no se recomienda por dos razones principales: 1) muchas muestras contienen abundantes bacterias que crecen muy bien a esta temperatura; 2) algunos hongos crecen mal a esta temperatura o no crecen, especialmente los hongos que infectan la piel. No hay ventaja en incubar simultneamente a 30C y a 37C. La temperatura de 37C debe reservarse para hongos dimrficos o algn
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hongo que se desarrolle mejor a esta temperatura. Los cultivos de hongos deben incubarse durante 3-4 semanas antes de ser desechados, y no deben desecharse cuando se asla un hongo, sino que debe completarse el periodo de incubacin. Sin embargo, hay muestras que se pueden eliminar antes (por ejemplo, exudado vaginal), a los 7 das, cuando se realizan cultivos habituales.

IDENTIFICACIN
HONGOS FILAMENTOSOS Cuando el crecimiento detectado corresponda a un hongo filamentoso, la identificacin se debe hacer por el examen macroscpico de la colonia: forma, color, textura, velocidad de crecimiento y reverso. Si el hongo tiene abundantes formas de reproduccin se emplea la tcnica del scotch o papel de celofn, que consiste en tocar la superficie de la colonia con la cinta adhesiva y colocarla sobre un porta, en el que se ha depositado una gota de azul de lactofenol y observar al microscopio. Cuando no se puede conseguir una buena observacin de las formas de reproduccin por las tcnicas anteriores, es necesario hacer un microcultivo. Esta tcnica consiste en depositar sobre un porta un trozo de agar de Sabouraud, o del medio recomendado segn el gnero de hongo filamentoso que se presume, de 1 cm2 de superficie aproximadamente, en cuyos extremos se inocula el hongo problema (en profundidad). Posteriormente se le coloca un cubre encima y se incuba en cmara hmeda a 25C hasta observar crecimiento; entonces se toma el cubre, que es donde se han depositado las formas de reproduccin, y se coloca sobre un porta que lleva una gota de azul de lactofenol y se observa al microscopio. Los criterios de identificacin son fundamentalmente morfolgicos basados en la presencia de estructuras de reproduccin sexual, estructuras de reproduccin asexual y caractersticas especiales de las hifas, cuya descripcin pueden ser consultados en atlas micolgicos. En ocasiones, la identificacin se complementa con pruebas bioqumicas, como la investigacin de la ureasa, que diferencia T. mentagrophytes (positivo) de T. rubrum (negativo). Todava limitada a determinados laboratorios especializados, pero en continuo desarrollo, est la identificacin molecular de los aislamientos fngicos, basada en los mapas de restriccin de fragmentos del opern ribosomal, digeridos con un panel de enzimas de restriccin, que permite la elaboracin de rboles filogenticos. LEVADURAS La identificacin de la especie de toda levadura aislada en sangre o en cualquier otro lquido corporal estril est plenamente justificada. Tambin es conveniente la identificacin de las levaduras de otras procedencias, sobre todo cuando ocurre de forma reiterada en diferentes muestras clnicas del mismo paciente, y siempre que se asuma que se trata de un organismo responsable de patologa. La mayora de los organismos levaduriformes crecen fcilmente en un gran nmero de medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de microbiologa (agar sangre, agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el AGS, con o sin antibiticos aadidos, es el medio de aislamiento por excelencia para la identificacin de levaduras. En el medio AGS las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente abombadas o planas, de consistencia mantecosa, lisa o rugosa, con olor dulzn agradable, volvindose ms pastosas a medida que la colonia envejece. Por lo general, las colonias de levaduras no desarrollan micelio areo, aunque en ocasiones pueden aparecer prolongaciones aracneiformes en la periferia de las colonias. Identificacin convencional. Si se visualiza crecimiento en cualquier medio que sugiera posibilidad de levaduras, se realiza una extensin en fresco. Si en la misma se observan levaduras, se procede a la identificacin mediante subcultivo a un medio cromognico, Cromocandida. En el caso que
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no se trate de ninguna de las especies que este medio identifica, se procede a hacer la identificacin mediante auxonograma de carbono preparado en el propio laboratorio, o mediante alguno de los mtodos comerciales basados en l. La identificacin bioqumica debe completarse con una identificacin morfolgica mediante un subcultivo al medio agar harina de maz con o sin Tween 80. Si se observa un micelio areo definido, debe considerarse la posibilidad de que se trate de un hongo dimrfico o de ciertas especies de levaduras que pueden formar micelio verdadero como Geotrichum, Dipodascus o Trichosporon. Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la formacin de cpsulas y puede ser el paso inicial para la identificacin de C. neoformans. Las colonias de color rojoanaranjado o naranja, de aspecto cremoso o rugoso son caractersticas de las especies del gnero Rhodotorula ( rhodo: rojo), color que manifiesta esta levadura por su riqueza en carotenoides.

Otros medios diagnsticos complementarios

- Prueba del tubo germinal o filamentacin precoz: el tubo germinal es una extensin filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la clula progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la clula madre. Slo C. albicans, y en menor medida C. dubliniensis, son capaces de producir verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras especies como C. tropicalis pueden producir pseudohifas precoces de aspecto similar a los tubos germinales pero con una zona de constriccin caracterstica adyacente a la clula madre, por lo que esta prueba es til para diferenciar C. albicans y C. dubliniensis del resto de las especies de Candida. Falsos negativos: aproximadamente un 5% de cepas de C. albicans dan negativa la prueba de los tubos germinales. Si se utiliza un inculo demasiado abundante de levaduras, tambin pueden obtenerse falsos resultados negativos. Metodologa: 1) emulsionar una porcin de la colonia aislada en 0,5 ml de suero humano, de caballo o de conejo. 2) Incubar a 35C durante 2 horas. 3) Depositar una gota de la emulsin sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, colocar un cubre-objetos y visualizar a 100 X, 400 X 1000 X. Interpretacin: La prueba es positiva si se visualizan tubos germinales. - Deteccin de ureasa: una levadura con reaccin positiva a la prueba de la ureasa es sugestiva de pertenecer al gnero Cryptococcus. Concretamente, las cepas de C. neoformans comienzan a provocar cambio de color a las 2 horas de incubacin a 35C en un tubo de urea de Christensen inoculado con una colonia del aislado sospechoso. Esta prueba tambin puede utilizarse para diferenciar Trichosporon (ureasa positiva) de Geotrichum (ureasa negativa). - Prueba de la enzima nitrato-reductasa: la capacidad de C. neoformans de reducir nitratos a nitritos es una prueba de utilidad cuando se pretende identificar esta levadura. Procedimiento: 1) pasar la punta de un hisopo por la superficie de 2-3 colonias aisladas de un cultivo de 48-72 horas de crecimiento en cualquiera de los medios habituales. 2) Incubar el tubo con el hisopo a 45C durante 10 min. 3) Sacar el hisopo y agregar al tubo 2 gotas de alfa-naftilamida y 2 gotas de cido sulfanlico. 4) Reintroducir el hisopo en el tubo para que absorba los reactivos. Interpretacin: el desarrollo inmediato de un color rojo indica una reaccin positiva. - Prueba de la fenol-oxidasa: C. neoformans produce fenol-oxidasa, una enzima necesaria para el metabolismo de la 3,4-dihidroxifenilanina (DOPA) y otros compuestos fenlicos en la sntesis de la melanina. Esto se evidencia por la produccin de un pigmento marrn oscuro o negro alrededor de la colonia de C. neoformans en el medio que contenga catecoles, como el cido cafeico, o el medio preparado con semillas de nger ( Guizotia abyssinica). Interpretacin: el desarrollo de una pigmentacin marrn oscura alrededor del crecimiento es carac24

terstico de C. neoformans. -Deteccin de antgenos y Anticuerpos :Se han descrito numerosas tcnicas para la deteccin de antgenos fngicos, algunas de ellas incluso disponibles comercialmente. Ltex para Cryptococcus: este mtodo de aglutinacin se utiliza para la deteccin del polisacrido capsular de C. neoformans, tanto en suero como en LCR, con fines diagnsticos y de monitoreo de la terapia. Tiene una sensibilidad cercana al 95% y una especificidad entre 93 y 100%15,16. Inmunofluorescencia para Pneumocystis jiroveci (ex carinii): esta tcnica utiliza anticuerpos monoclonales especficos contra determinantes antignicos de la pared de los quistes y trofozoitos de P. jiroveci. Tiene una sensibilidad reportada cercana a 100% y una especificidad de alrededor de 96% 17,18. Antigenemia para bsqueda de Aspergillus spp: recientemente se ha incorporado un inmunoensayo tipo "sandwich" comercial que utiliza un anticuerpo monoclonal dirigido contra la cadena lateral 1,5 b-D galactofuransido del galactomanano. El ensayo tiene un lmite de deteccin entre 0,5 y 1,0 ng/ ml de suero, superior a los 15 ng/ml de suero descrito para el ltex existente previamente. En un estudio cuyo estndar de oro fue el cultivo y la histologa, la sensibilidad fue de 92,6% y la especificidad de 95,4%. El test fue positivo en promedio 6 das antes que la sospecha clnica19. Actualmente se considera que un examen positivo debe ser confirmado con una segunda muestra y forma parte de los criterios usados por EORTC y NIAID para definir micosis invasoras. Deteccin de antgenos de Candida spp: mtodo de aglutinacin con partculas de ltex para un antgeno termolbil no bien caracterizado, que en los diferentes estudios ha mostrado valores desde 25 hasta 100% de sensibilidad para el diagnstico de candidiasis invasora, y por lo tanto no existe consenso sobre su utilidad clnica. Otras molculas blanco como por ejemplo manano, enolasa y Darabinitol, han sido estudiadas para el diagnstico de candidiasis invasora, pero lamentablemente todos estos ensayos han tenido una utilidad muy limitada.. -Biologa molecular Debido a las dificultades tanto de sensibilidad, especificidad y retardo de las tcnicas microbiolgicas tradicionales, se han desarrollado durante la ltima dcada diversas tcnicas en el campo de la biologa molecular con gran potencial en el rea del diagnstico micolgico, tanto para la pesquisa e identificacin del agente causal como para la evaluacin de clonalidad con distintos fines. Entre las tcnicas ms difundidas est la amplificacin por RPC, especialmente por su alta sensibilidad y rapidez. Esta tcnica se ha implementado en diferentes aproximaciones: RPC con partidores especie o gnero -especficos, RPC y Southern blot, RPC y anlisis con enzimas de restriccin, RPC anidada, RPC en tiempo real, RPC con anlisis de fragmentos y secuenciacin.

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PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
Los medios de cultivo necesarios para hacer las pruebas de sensibilidad dependern del mtodo que se siga. En general son medios sintticos definidos, como el RPMI con o sin glucosa. Se deben hacer pruebas de esterilidad del medio as como de medida del pH, que debe situarse alrededor de 7,0 0,3. En caso contrario, los antifngicos pueden perder parte de su capacidad inhibitoria. Los antifngicos deben obtenerse en forma de sustancia valorada solicitndolos al laboratorio que los produce o en aquellos casos en los que sea posible, adquirindolos a travs de un distribuidor acreditado. Debe conocerse el nmero de lote, potencia, fecha de caducidad y condiciones de conservacin. Las formulaciones preparadas para uso clnico no deben emplearse, pueden tener excipientes o formulaciones indeseables. Los mtodos de referencia describen con precisin todo el proceso de preparacin de soluciones madre de los antimicrobianos, de las placas o tubos con concentraciones decrecientes, del inculo, de la forma de inoculacin y de lectura. Se aconseja realizar recuentos en placa a partir de las suspensiones inoculadas para comprobar que no se han cometidos errores en la preparacin del inculo. Deben incluirse cepas control (ver PNT-MIC-05) en todas las pruebas para poder validar los resultados. Si se decide utilizar un mtodo comercial deben seguirse fielmente las instrucciones del fabricante. Las condiciones de incubacin no son especiales. Generalmente se cultivan en atmsfera normal, a 30 35C, durante 24-72 horas, dependiendo del mtodo y de las especies fngicas.

Panel Sensititre Yeast One para el estudio de la sensibilidad in vitro

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BIBLIOGRAFA
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