Prcticas de laboratorio de microbiologa

Introduccin
Todas las personas que trabajan con materiales que contengan agentes infecciosos deben estar conscientes de los peligros potenciales asociados a estos agentes, adems deben estar entrenadas en las prcticas y tcnicas requeridas para manejar estos materiales de una manera segura. Es por ello que antes de comenzar con las actividades prcticas, todas las personas involucradas (estudiantes y docentes) tenemos la obligacin de conocer cules son las normas de seguridad a seguir en el laboratorio de manera tal, que el trabajo se realice con un riesgo mnimo de exposicin, tanto para las personas que lo ejecutan como para el medio ambiente. El objetivo general de esta lectura, es ofrecerle al estudiante una gua para que realice sus actividades prcticas en el Laboratorio de Microbiologa de una manera adecuada y segura.

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PRACTICA N 01 RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO MATERIALES: 1. TUBOS DE ENSAYO: Son de vidrio, es empleado para conservar microorganismos en medios de cultivo lquido o slido. Hay de diferentes formas y capacidades, con borde o sin borde pero, lo que ms importa es su calidad termo resistente, es decir, su resistencia al calentamiento y a los cambios bruscos de temperatura.

2.

PLACAS PETRI: Son materiales de vidrio que se utiliza para aislar microorganismos provenientes de diversas fuentes infecciosas.

3.

PIPETAS: Son materiales de vidrio destinados a medir volmenes pequeos de medios de cultivo lquidos u otras sustancias. Hay graduadas de 0.1 ml hasta 10 ml.

Pipetas graduadas con jeringa hermticamente esmerilada

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4. MATRAZ DE ERLENMEYER: Son recipientes de vidrio en forma cnica que disponen una escala graduada y permiten estimar o aproximar volmenes de lquidos. Se emplea para disolver medios de cultivos y conservarlos; los hay de varias capacidades de 25 ml hasta 5 litros.

5.

BALONES: Son recipientes de vidrio de fondo plano (matraz Florencia), que sirve mayormente como contenedor, tiene similar funcin que el matraz de Erlenmeyer

6.

MATRAZ DE KITASATO: Son recipientes de vidrio, de forma cnica, similar al Erlenmeyer, con la diferencia que en la parte del cuello posee un orificio lateral de salida. Se emplea para realizar filtraciones al vaco.

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7. PROBETAS: Son recipientes cilndricos graduados de vidrio grueso, con pico y con base para poderlos parar. Se emplean para medir volmenes de lquidos. Hay de diferentes volmenes, de 5 ml a 2 litros

8.

BAGUETA: Llamadas tambin agitadores. Son varillas slidas de vidrio. El largo del agitador est determinado por el tamao y la forma del recipiente en que se emplea, as en vasos de precipitados. Sirven para homogenizar muestras y transportar pequeas cantidades de ella; agitar y trasvasar lquidos; desprender partculas de precipitados adheridos al recipiente que no se pueden sacar.

9.

BEAKER: Son vasos de vidrio que se utilizan para efectuar mezclas y titulaciones. Hay de diferentes volmenes, de 25 ml a 500 ml

10. JERINGAS Y AGUJAS HIPODERMICAS: son materiales peligrosos que necesitan manejarse con precaucin para evitar la inyeccin accidental o a generacin de aerosoles durante las inoculaciones. Generalmente, la utilizacin de las mismas debe restringirse a los procedimientos para los que no existe una alternativa. Las agujas no deben doblarse, romperse, guardarse en la funda, o quitarlas de la jeringa despus de su uso.

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11. PORTA Y CUBRE OBJETOS: Son de vidrio. El porta objetos sirve para montar muestras de microorganismos, es ms grande y ms grueso que el cubre objetos, ya que ste sirve para cubrir las muestras montadas y permitir una mejor visualizacin.

12. PIPETAS PARA RECUENTO DE GLOBULOS ROJOS: Es graduada a una dilucin de 1/200. Es de vidrio con una cpsula en la parte sub terminal que permite almacenar el lquido diluyente en la sangre para una mezcla adecuada.

13. CAMPANA DE BREWER: Son de vidrio pirex, grueso y tienen mayor resistencia mecnica y trmica. Se usa para mantener una ambiente carente de oxgeno cuando se trabajan con bacterias exigentes. El borde esmerilado debe estar ligeramente cubierto con vaselina blanca o alguna grasa blanca especial, para conseguir un cierre hermtico al aire.

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14. ASA DE KOLLE: Consiste de dos piezas: el mango de Kolle y el asa, de bronce cromado y mango con bakelita. Son de un material inoxidable. Sirve para tomar muestras y poder realizar el cultivo en las placas petri.

15. MECHERO DE BUNSEN: Son aparatos para mantener un ambiente de esterilidad cuando se trabajan con siembra de microorganismos.

16. TRIPODE: Es de metal, construido de un anillo circular apoyado en tres patas equidistantes, que son varillas delgadas. Se utilizan para colocar sobre el la malla de asbesto en una operacin de calentamiento de cualquier matraces con medios de cultivo.

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17. GRADILLA: Es de metal o de madera. Es una especie de escalerilla porttil y sencilla. Sirve para portar a los tubos de ensayo durante un trabajo con stos.

18. GOTERO: Son tubos de vidrio, cortos y delgados, donde en uno de los extremos se adapta una perilla o bombilla de goma y en el otro extremo se encuentra estrangulado. Se emplea para la adicin de pequeos volmenes (gotas) de colorantes en tinciones.

1.

EQUIPOS AUTOCLAVE: Es un equipo cuyo uso se destina a la esterilizacin de material para laboratorio. En la parte superior hay un termmetro y un barmetro que funciona: esterilizacin por aumento de la temperatura a altas presiones. INCUBADORA: Sirve para mantener en la temperatura adecuada al cultivo de bacterias. Mantiene a una temperatura de 37 a 34 C

2.

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CONCLUSIONES
Es muy importante haber reconocido todos los materiales a utilizar en el laboratorio y saber su utilidad para la prctica.

Tambin era necesario para prevenir cualquier accidente no provocado y no lamentar consecuencias.

Conocer la calidad de las principales herramientas a utilizar como los tubos de ensayo, las pipetas, las cajas petri, los matraces, etc.

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INTRODUCCION
El microscopio es el instrumento ms frecuentemente utilizado y el ms til en un laboratorio de Microbiologa, proporciona la amplificacin o agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos de miles de veces. Las dos categoras de microscopios disponibles son los microscopios pticos y los microscopios electrnicos. Los microscopios pticos utilizan un sistema de lentes pticas y comprenden los microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios electrnicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de luz para producir una imagen ampliada.

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PRACTICA N 02 MANEJO DEL MICROSCPIO Y EL MUNDO MICROBIANO MATERIAL Microscopio compuesto Porta y cubre objetos Palillo Hisopos Agua estancada MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10X) si la preparacin es de bacterias. Para realizar el enfoque: Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntido la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.

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PROCEDIMIENTO : Tcnicas de montaje hmedo La gota pendiente o las preparaciones hmedas permiten examinar organismos vivos suspendidos en un fluido. Las preparaciones hmedas se hacen colocando una gota del fluido que contiene el organismo sobre una lmina de vidrio y cubrindola con una fina pieza de vidrio (cubreobjetos): para reducir la tasa de evaporacin y eliminar corrientes de aire, generalmente se rodea la gota con vaselina. Cuando se examinan las preparaciones hmedas por microscopa de campo claro, es importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es posible disminuir la intensidad de la luz mediante la utilizacin de filtros especiales. Utilizada para estudiar la movilidad de los microorganismos En el centro de un portaobjetos coloca una gota de agua estancada Con una laminilla cubre cuidadosamente dicha gota, sin formar burbujas de aire Examina con objetivos de 10X y 40X.

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CUESTIONARIO: 1. Qu es poder de resolucin? Es la capacidad que se tiene con ese microscopio de poder ver dos puntos en forma separada. Cuando la distancia entre los puntos disminuye se llega a un lmite a partir del cual ya no se ven los puntos en forma separada, sino unidos. En ese momento se ha alcanzado el lmite de resolucin del microscopio. 2. Con qu finalidad se utiliza el microscopio compuesto?

El microscopio compuesto se utiliza para examinar objetos muy pequeos situados a distancias muy cortas. En su forma ms simple est formado por dos lentes convergentes: - La lente ms cercana al objeto O1, denominada objetivo, forma una imagen real O2, invertida y mayor que el objeto. - La lente ms prxima al ojo, denominada ocular, se utiliza como una simple lupa para observar la imagen O2 formada por el objetivo. El ocular se coloca de tal forma que la imagen O2 formada por el objetivo caiga en el punto focal del ocular. En consecuencia, la luz emerge del ocular en forma de haz paralelo como si procediese de un punto situado a una gran distancia delante de la lente produciendo una imagen final O3, que aparece invertida con respecto al objeto O1.y de mucho mayor tamao. 3. Cual es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio?

El DIAFRAGMA anexado a la parte inferior del Condensador permite regular la cantidad de luz proveniente del Espejo mediante un mecanismo de apertura y cierre similar al de la pupila del ojo humano. 4. Qu diferencias hay entre el microscopio ptico y electrnico? "Microscopios pticos": Microscopio ptico de campo claro: formado por dos series de lente (objetivo y ocular) que funcionan conjuntamente para producir la imgen, aqu la muestra se visualiza por contraste entre ella y el medio que la rodea. Se utilizan tinciones para favorecer el contraste. Se utilizan colorantes con cargados positivamente porque se combinan con los componentes celulares que estn cargados negativamente. Microscopio ptico de contraste de fases: aumenta el contraste, no hace falta teir la clula porque se basa en los distintos ndices de refraccin entre la clula y el medio desviando los rayos de luz; formndose una imgen oscura con un fondo brillante. Microscopio ptico campo oscuro: en este la luz incide sobre la muestra slo desde los lados, la luz al ser dispersada por la muestra entra en el objetivo, observndose la muestra brillante sobre el fondo oscuro.

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"Microscopio

electrnico":

Microscopio electronico de transmicin: se utilizan electrones en lugar de rayos de luz, y la funcin de las lentes la realizan electromagnetos, operndose al vaco. Tiene alta resolucin, pero los haces electrolitos poseen bajo poder de penetracin por eso se utilizan tcnicas de cortes ultrafinos. Para aumentar el contraste se preparan las muestras con compuestos como el cido smico, permanganato, uranio, lantano o plomo porque desvan adecuadamente los electrones. Microscopio electronico de barrido: la muestra se recubre con una fina capa de un metal pesado, como el oro. el haz de electrones barre la superficie de la muestra, los electrones desviados por la capa de metal son recogidos y proyectados sobre una pantalla para producir una imgen. "Todos los microscopios electrnicos incorporan cmaras que permiten fotografiar las muestras". 5. Que importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos en muestras biolgicas frescas?

Si es importante porque cuando haces una preparacin y la dejas enfrascada por mucho tiempo, tiende a cambiar el pH y esto puede afectar tus experimentos 6. Escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto

Sistema mecnico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y dems elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo). Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y resolucin (objetivos y ocular) Sistema de Iluminacin: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no) y transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van a incidir sobre el espcimen (lmpara o fuente de iluminacin, espejo, condensador y diafragma). Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del instrumento (cmaras fotogrficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros).

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OBSERVACIONES Dibuja lo observado en los diferentes objetivos para cada muestra que preparaste durante el experimento.

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Conclusiones
El microscopio ha sido y ser el instrumento de mayor utilidad en el estudio de las clulas y tejidos. Para resaltar los detalles de los especmenes, adems de las coloraciones se han creado microscopios especiales para tal fin, permitiendo adems la observacin de clulas vivas, con las ventajas que esto trae consigo. El poder de aumento de los microscopios se ha perfeccionado al conocer los mecanismos involucrados en la formacin de las imgenes, modificando en los instrumentos algunos elementos tales como el tipo de iluminacin, el sistema ptico o el mtodo para obtener las imgenes, logrando incrementar la resolucin de los instrumentos. Actualmente pueden verse desde elementos ultra estructurales cuyas dimensiones estn en el orden de las micras, hasta elementos atmicos de dimensiones nanomtricas. Se ha demostrado que la capacidad de aumento de un microscopio depende de la longitud de onda del tipo de radiacin que se emplee, establecindose la relacin de manera inversamente proporcional, es decir, a menor longitud de onda, mayor poder de resolucin. Disminuir la longitud de onda permite ver objetos cada vez ms pequeos de manera individualizada, lo que a su vez aumenta la calidad de los detalles de lo que se observa.

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INTRODUCCIN
TINCION DE GRAM Tincin empleada en microbiologa para la visualizacin de bacterias en muestras clnicas. Tambin se emplea como primer paso en la diferenciacin bacteriana. El examen con microscopio ptico de preparacin con tincin de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las formas comunes son cocos, bacilos y formas espiraladas Las bacterias pueden diferenciarse con esta tincin en dos grupos. Los microorganismos Gram positivos se tien de azul, mientras que aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espiralados se tien de rojo y se dice que son Gram negativos. Las aplicaciones ms comunes de la coloracin de Gram son las siguientes: La presencia de cocos Gram positivos agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos La presencia de diplococos Gram negativos son caractersticas de especies de Neisseria Los bacilos Gram positivos grandes sugieren especies de Bacillus o Clostridium, los bacilos Gram positivos pequeos sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes (difteroides) Los bacilos Gram negativos son las bacterias ms comunes halladas en los laboratorios clnicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentados y especies de Haemophilus. El valor diagnstico de esta tincin es variable; normalmente permite una buena orientacin al microbilogo para seleccionar las tcnicas de cultivo ms adecuadas y tambin tiene valor en orientar hacia un diagnstico etiolgico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.

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PRCTICA N 03 COLORACIONES BACTERIANAS: COLORACIN DE GRAM
MATERIAL Asa de Kolle Microscopio Porta objetos Cultivo de Staphylococcus aureus Cultivos de Escherichia coli Cultivo de Candida albicans Aceite de inmersin Cristal violeta Alcohol acetona Safranina Lugol para Gram

PROCEDIMIENTO

PRODUCTOS QUE SE UTILIZAN

REACCIN Y COLORACIN DE LAS BACTERIAS GRAM Clulas color violeta Se forma el complejo CV-I. Las clulas continan teidas de color violeta. Eliminacin por extraccin de grasas de las paredes celulares. Aumenta la porosidad. El complejo CV-I se separa de la clula. Clulas decoloradas; se tien de color rosado.

GRAM + CRISTAL VIOLETA Clulas color violeta Se forma el complejo CV-I. LUGOL Las clulas continan teidas de color violeta. Se deshidratan las paredes celulares. Se ALCOHOL contraen los poros. ACETONA Disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las clulas que continan teidas de color violeta. Clulas no decoloradas; SAFRANINA quedan teidas de color violeta.

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FROTIS Coloca una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente. Flamea el asa de siembra y toma en condiciones aspticas una pequea cantidad del cultivo bacteriano y transfirelo a la gota de agua. Remueve la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario que realices los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. FIJACIN Acerca la lmina a la llama del mechero para que la muestra se seque en forma paulatina. En este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar demasiado la lmina, pues las clulas pueden deformarse o romperse. COLORACIN Tie con cristal violeta, 1minuto. Lava con abundante agua el exceso de colorante. Cubre con Lugol, 1 minuto. Lava con agua el exceso de Lugol. Decolora con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparacin deje de perder color (30seg) Lava con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. Tie con safranina 1 minuto. Lava con agua para eliminar el colorante de contraste. Seca la preparacin. Examina al microscopio con aceite de inmersin y fijndote sobre todo en el color de cada preparacin.

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CUESTIONARIO
1. Qu es un colorante? Tipos COLORANTES: Sustancias orgnicas coloreadas que se utilizan para colorear otros objetos; solubles en medio cido, neutro o bsico, que poseen una estructura molecular no saturada, Es decir son electrnicamente inestables y por eso absorben energa a determinada longitud de onda, si fueran estables absorberan todas o rechazaran todas. Los colorantes se clasifican, teniendo en cuenta si la propiedad tintorial se encuentra en el anin o el catin de su estructura qumica. Sobre esta base se pueden dividir en tres grupos: bsicos, cidos y neutros. Colorantes bsicos: La accin colorante est a cargo del catin, mientras que el anin no tiene esa propiedad, por ejemplo: - cloruro de azul de metileno+. Colorante cido: Sucede todo lo contrario, la sustancia colorante esta a cargo del anin, mientras que el catin no tiene propiedad, por ejemplo: eosinato- de sodio+ Colorantes neutros: Estn formados simultneamente por soluciones acuosas de colorantes cido y bsicos, donde el precipitado resultante, soluble exclusivamente en alcohol, constituye el colorante neutro, que tiene la propiedad tintorial de sus componentes cidos y bsicos, por ejemplo: la giemsa.

2.

Con qu finalidad se fija la muestra de microorganismos en el portaobjetos?

El portaobjeto es el vidrio sobre del cual pones el objeto que vas a observar 3. Qu tipos de coloraciones conoces, descrbelos

La coloracin o tinciones en microbiologia: consiste en cubrir las preparaciones con uno o varios colorantes de forma secuencial durante un tiempo determinado. Existen las tinciones simples que se usan para observar la morfologa y el agrupamiento bacteriano, entre los colorantes tenemos el azul de metileno, cristal violeta y fuscina. las tinciones dobles o diferidos; se usan para poner de manifiesto diferencias entre microorganismos o parte de ellos, la tincin de gram, es la ms utilizada en Microbiologa, ya que diferencia a las bacterias en gram positivas y gram negtivas, segn retengan el cristal violeta utilizado en la tincin, las gram negativas no retienen el cristal violeta cuando son decoloradas por una mezcla de alcohol y acetona. las gram positivas (+) si retienen el colorante inicial, las gram negativas (-) se cogeran el segundo colorante; la safranina y presentan color rojo. Microbiologa ambiental Pgina 19

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En la tincin de Zich-Neelsen: que se usa para presenciar de bacilos resistentes en cido-alcohol se usa el colorante carbol-fuscina o fuscina feniada y el azul de metileno. las bacterias resistentes quedan teidas de rojas y las no resistente color azul. En la tincin de esporas por el metodo de Wirtz o de verde malaquita en caliente y posterior utilizacin de fuscina como contracolorante, las esporas existentes se teiran de verde , mientras que otras formas vegetativas , se tien derojo. Tincin de colorante auramina-rodamina; estos dos fluorocromo se fijan sobre el cido micolico de la pared celular de las micobacterias, apareciedo como puntos de color amarillo-verdoso brillantes sobre fondo negro. tincin de naranja de acridina, el cual se basa en la tincin selectiva y diferencial de los cidos nucleicos por parte del fluorocromo naranja de acridina, dando un color los microrganismos rojo-anaranjado 4.Por qu es necesario emplear aceite de inmersin para la observacin de los microorganismos?

Es especial debido a su viscosidad que es de tipo A., se utiliza colocando una gota en el objetivo para facilitar la visin del microscopio al entrar en contacto con el cubre-objetos.

5.

De los reactivos que utilizaste para la tincin de Gram, El cristal violeta a qu estructuras de la bacteria colorea?

Colorea alas GRAM(+) de color violeta y a las GRAM(-),de color violeta. 6. Por qu se dice que la coloracin Gram es de orientacin?

Porque nos permite diferenciar dos grandes grupos de eubacterias ,GRAM (+) y GRAM (-). 7. Menciona cinco bacterias Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas: 8. Bacillus anthracis: ntrax Stretococcus dneumoniae: neumona Staphylococcus aureus: foliculitis Clostridium tetani: ttanos Clostridium botulinum: botulismo

Menciona cinco bacterias Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas Bacillus anthracis: ntrax Stretococcus dneumoniae: neumona Staphylococcus aureus: foliculitis Clostridium tetani: ttanos Clostridium botulinum: botulismo Pgina 20

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OBSERVACIONES: Realiza los dibujos y esquemas correspondientes a la coloracin realizada

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INTRODUCCIN
Los microorganismos pertenecientes al gnero Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes bacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lpidos (cidos miclicos), que la hace impermeable a los agentes hidroflicos. Las Mycobacterias son teidas adecuadamente por el mtodo de Ziehl-Neelsen (Tincin cido-Rpida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solucin decolorante una mezcla de etanol y cido clorhdrico. Son bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR) por lo que la tincin de Ziehl-Neelsen es til para la coloracin de estos microorganismos obtenidos de muestras clnicas o de cultivo. Con esta tincin, los bacilos aparecen de color rojo brillante sobre un fondo azul. Los bacilos tuberculosos son difciles de teir con la tincin de Gram, y se observan como bacilos Gram positivos con tincin irregular. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloracin cido-alcohlica y por eso se denominan Bacilos cido Alcohol Resistentes (BAAR) El gnero Mycobacterium incluye ms de 100 especies que pueden clasificarse en seis grupos desde el punto de vista bacteriolgico, pero con fines didcticos se dividen en tres apartados: Complejo tuberculosis. Incluye las especies M. tuberculosis, Mycobacterium bovis y Mycobacterium africanum, productoras todas ellas de tuberculosis. Se incluye tambin Mycobacterium microti, productor de tuberculosis en rata. Complejo lepra, en el que se incluyen las especies M. leprae, productor de la lepra humana y Mycobacterium lepraemurium, que produce lepra en roedores. El Mycobacterium leprae que es un parsito intracelular obligado que se multiplica lentamente en clulas fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las clulas de Shwan de los nervios Otras Micobacterias, no comprendidas en los dos grupos anteriores, slo algunas de ellas suelen ser patgenas, otras pueden ser patgenas oportunistas y finalmente otras suelen ser saprofitas. Producen las denominadas micobacteriosis las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas.

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PRCTICA N 05 COLORACIN CIDO-ALCOHOL RESISTENTE

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INTRODUCCIN
La dieta de todos los seres vivos requiere de alguna sustancia que contenga nitrgeno en forma que ellos puedan utilizar, tambin las dietas de los microorganismos requieren una fuente de nitrgeno utilizable. Muchos microorganismos son capaces de utilizar las protenas y los aminocidos como fuente de nitrgeno pero muchos otros no requieren forma tan compleja de este elemento. Los compuestos de nitrgeno inorgnico, como nitrato de potasio y fosfato de amonio, de hecho constituyen la nica fuente de nitrgeno para cierto tipo de microorganismos los cuales son capaces de fabricar aminocidos y protenas a partir de estos compuestos inorgnicos. Otras sustancias nutritivas son los carbohidratos (azcar, almidn, etc) generalmente los carbohidratos proporcionan energa rpida o el combustible del que la vida depende. La fuente de energa entre los microorganismos, algunos pueden utilizar la mayora de los carbohidratos mientras que otros nicamente algunos o ninguno. Otros microorganismo derivan si energa exclusivamente de compuesto inorgnicos, como el carbonato de sodio. Por otro lado al igual que otros seres vivos, los microorganismos requieren ciertas condiciones para crecer y reproducirse. En el laboratorio para estudiar los microorganismos y determinar su relacin con la enfermedad infecciosa, fermentacin u otro tipo de actividad, es necesario hacerlos crecer en medios de cultivos, proporcionndoles las condiciones fsicas qumicas optimas.

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PRCTICA N 05 MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es una sustancia liquida o solida que contiene compuestos naturales o artificiales adecuados para la vida, crecimiento y reproduccin de los microorganismos. Estos medios de cultivos deben de estar provistos de sustancias nutritivas parecidas en lo posible al medio natural en que los microorganismos viven y se reproducen. Para que un medio responda con xito en el cultivo de los microorganismos, debe cumplirse con las siguientes condiciones: 1. Contener las sustancias nutritivas necesarias para su crecimiento. 2. La humedad, el PH y la presin osmtica deben ser ptimos. 3. Debe estar previamente esterilizado. Adems es necesario proporcionar las condiciones adecuadas de tensin de oxigeno y temperatura de acuerdo a las necesidades de los microorganismos a fin de permitir su desarrollo en los medios de cultivos. Los medios de cultivos sirven para: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Aislamiento de grmenes Identificacin Conservacin Clasificacin Obtencin de toxinas Obtencin de masa celular en la preparacin de vacunas y otros fines. Estudios complementarios, como los de sensibilidad de las bacterias a los antimicrobianos.

CLASES DE MEDIOS I. Segn su origen: Medios naturales: son de origen animal o vegetal cuya composicin qumica estructural no se conoce con exactitud, por ejemplo: leche, peptonas, extracto de carne. Medios sinteticos: son aquellos que se conocen la identidad y la cantidad de cada compuesto qumico, es decir es un medio qumicamente definido con los cuales se puede aprender mucho sobre la nutricin microbiana. Ejemplo un medio con aminocidos, azucares, vitaminas, etc. Medios sintticos: son medios sintticos a los que se le agregan extractos orgnicos complejos como extracto de levadura, extracto de tejido, etc a fin de mejorar su valor nutritivo.

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II. Por su consistencia Lquidos: son conocidos como CALDOS y en su composicin no contiene sustancias gelificantes. Ejemplo caldo nutritivo, caldo tetrathionato, agua peptonada, etc. Slidos: estos medios resultan de aadir a un medio lquido un gelificante, siendo el AGAR el ms ampliamente empleado en la proporcin de 1 a 2 %. Tambin se emplea la gelatina, silica gal, etc. Ejemplo agar nutritivo, agar Mac Conkey, agar sabouraud, etc. Semislidos: son los medios lquidos a los que se agregan 0.2 a 0.5% de sustancia gelificante para darle una consistencia blanda. Se utiliza para estudios de movilidad de los microorganismos y como nutrientes para cepario. El gelificante mas utilizado es el AGAR polisacrido que se obtiene de algas marinas, por ejemplo a partir de gelidium corneuin. Su punto de fusin es de 98C y solidifica al enfriar a una temperatura de 35 a 40 C. La gelatina puede tambin emplearse como solidificarte, la cual es una protena derivada del colgeno de la piel, cartlagos, huesos y tendones y proporciona un gel satisfactorio a concentracin de 12 a 15%. III. Segn su funcin Medios comunes o bsicos: son los medios que contienen los requerimientos mnimos nutritivos necesarios para que pueda desarrollar un microorganismo. Ejemplo caldo nutritivo, agar nutritivo, agar leche peptonazada. Medios enriquecidos o mejorados: son aquellos medios bsicos que ha sido suplementados con sustancias de mayor valor nutritivo, como sangre, suero sanguneo, liquido asctico, yema de huevo, jugo de tomate, etc. Ejemplo agar sangre, agar chocolate, agar jugo de tomate, etc. Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen al crecimiento de un grupo de microorganismos e inhiben el de otros que se encuentran como acompaantes. Ejemplo caldo selenito, caldo tetrathionato, agar peptonado alcalino, etc. Medios selectivos: son usualmente medios bsicos a los cuales se les han agregado ciertas sustancias que impiden el crecimiento de la mayora de las bacterias, permitiendo por lo tanto el aislamiento de los microorganismos seleccionados. Estos son los llamados medios de aislamiento selectivo. Ejemplo agar telurito, agar Mac Conkey, agar hipertnico de chapman.

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Medios diferenciales: son medios bsicos o enriquecidos, a los cuales se les han agregado algunas sustancias conocidas que al ser utilizados o no por los microorganismos nos permiten diferenciarlos. Estos medios se utilizan para apreciar cambios bioqumicos especficos de un germen frente a determinado substrato, como formacin de gas, cambios en el PH, fenmenos de oxidoreduccin, etc. Ejemplo medios azucarados, agar gelatina, agar TSI, agar citrato.

TECNICAS DE SIEMBRA Es el procedimiento por el cual se coloca a los microorganismos en un medio de cultivo adecuado, para que en condiciones optimas de requerimiento de tensin de oxigeno, temperatura y tiempo de incubacin puedan desarrollarse y multiplicarse IN VITRO. Esta operacin se realiza teniendo en cuenta las siguientes precauciones: 1. Realizarlas en habitaciones cerradas, evitando corrientes de aire, para lo cual se recomienda el uso de una cmara de flujo laminar. 2. Identificar convenientemente los tubos y placas a sembrar. 3. Ejecutar la siembra cerca a la llama de un mechero para evitar la contaminacin. 4. Esterilizar el asa de platino antes y despus de la siembra 5. Flamear la boca de los tubos antes y despus de realizada la siembra 6. Poner en prcticas las normas de bioseguridad CLASES DE SIEMBRA 1. Por aislamiento Se realiza con la finalidad de separar especies microbianas para obtener un cultivo puro a partir de una muestra problema (orina, heces, agua, alimentos, secreciones, etc). Una vez aislado el cultivo puro se identifica las especies valindose de sus propias caractersticas. Estas siembras pueden hacerse por: agotamiento en superficie y por dilucin sucesiva. A. Por agotamiento en superficie: cosiste en diseminar los microorganismos en la superficie del medio en placas de petri. Puede hacerse: Aislamiento por estra con asa de Kolle Aislamiento por estra con aguja de Kolle Aislamiento por extensin con esptula de Drigaslsky B. Por diluciones sucesivas: consiste en hacer sucesivas diluciones en una muestra y luego colocar 1 ml de cada dilucin en placas Petri. A continuacin se vierte el medio licuado y manteniendo a 45 C (siembra por incorporacin o vaciado en placa) rotando luego las placas a fin de homogenizar la muestra en el medio.

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2. Por trasplante Se realiza con la finalidad de hacer perdurar el microorganismo transfiriendo peridicamente de un cultivo a un medio de cultivo, o bien para realizar la identificacin bioqumica. Por lo general se realiza en tubo a tubo, en medio lquido o solido y pueden ser: OBJETIVO Reconocer la importancia, clasificacin y el empleo de los medios de cultivo. Ejecutar las diversas tcnicas de siembra para aislar y transferir bacterias. DISEO EXPERIMENTAL Materiales Cultivo de bacterias en medios lquidos y slidos. Tubos de caldo nutritivo, caldo de selenito, agar nutritivo y agar semislido. Placas con agar nutritivo, agar Mac Conkey, agar manitol hipertnico y agar sangre. Muestra de orina, leche, saliva, etc. Placas Petri., esptulas de Drigalsky, pipetas. Matraz con agar nutritivo licuado y mantenido a 45C Asas de siembra, mecheros, etc. De solido a solido De solido a liquido De liquido a liquido De liquido de solido

PROCEDIMIENTO a. Siembra por inoculacin o agitacin Se realizan en tubos con medios lquidos. Con el asa de siembra estril tome una cantidad suficiente de inoculo o muestra e introduzca en el liquido y agite. b. Siembra por estras Se realiza en tubos con agar inclinado, introduciendo esta vez el asa con el inoculo hasta el fondo de la parte inclinada y deslice suavemente en zigzag en la superficie del medio sin perforarlo hasta el extremo superior del mismo. c. Siembra por puntura o picadura Se realiza en tubos con agar semislidos. Con el asa de siembra este en forma de aguja, tome una cantidad suficiente de inoculo o muestra e introdzcalo en forma vertical en el centro del medio.

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d. Siembra por estras agotamiento Se realiza en placas con medios slidos y tiene por finalidad obtener colonias aisladas de microorganismo a partir de una mezcla a fin de obtenerlas en forma pura. Con el asa de siembra que contiene el inoculo siembre una lnea en forma de zigzag sobre un cuarto de la superficie del medio sin daarlo, esterilice el asa de siembra y sin tomar de nuevo inoculo trazar otra lnea en zigzag en perpendicular a la anterior de tal modo que crucen a la anterior. Repetir esta operacin 2 veces ms. e. Siembra por agotamiento con esptula de Drigalsky Se realiza en placas con medios slidos. Tome cuatro placas con medio solido y numerarlas sucesivamente, luego en la primera colocar con una asa o pipeta Pasteur una gota de la muestra, seguidamente extenderla sobre toda la superficie del medio con el empleo de una asa de vidrio o Drigalsky; sin esterilizarla deslice sobre toda la superficie sin estropear el medio de la placa siguiente y as sucesivamente hasta sembrar todas las placas numeradas. f. Siembra por diluciones sucesivas Por incorporacin o placa vertida Realice diluciones sucesivas de la muestra y con una pipeta coloque 1 ml de dilucin en cada una de las respectivas placas de Petri. Esterilizadas y luego agregue 20 ml a cada una de ellas de medio de cultivo licuado y mantenido a 45C. Rotar la placa para homogenizar la muestra y deje solidificar. En superficie Se realiza en medios slidos, ejecutndose las diluciones de forma similar al anterior y coloque en este caso 0.1 ml de cada dilucin es la cual es extendida en toda la superficie el medio con el uso de una esptula de vidrio o Drigalsky.

RESULTADOS Y OBSERVACIONES (esquematic los mtodos de siembra ejecutados)

CUESTIONARIO 1. Liste cinco especies microbianas con sus respectivos medios de cultivo utilizados en su aislamiento. a) El agar de mc conkey

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b) c) d) e) tergitol 7 xld ss agar eosina y azul de metileno.

2. para que se utilizan las soluciones indicadoras en un medio de cultivo? En Estado Slido: En este estado, el Agar-Agar es poroso, translucido y membranoso, se le encuentra, generalmente, presentando un color blancoamarillento. Muy quebradizo cuando est seco y, prcticamente, insoluble en agua a 25C, pero solubiliza en agua a 100C. Es ligeramente soluble en etanolamina y soluble en formamida. En Solucin: En solucin se puede romper su equilibrio elctrico, agregando sales como sulfato de magnesio, de sodio o de amonio, lo que produce la precipitacin parcial de la agaropectina, siendo este mtodo muy utilizado para la obtencin de derivados. La viscosidad de las dispersiones de Agar-Agar es altamente influida por el tipo de alga y las condiciones del proceso utilizado. La viscosidad de una dispersin de Agar a 45C permanece relativamente constante, entre pH 4,9 y 9,0, que no es muy afectada por el tiempo, ni por la fuerza inica, cuando el pH est entre 6,0 y 8,0. Sin embargo, cuando comienza la gelificacin, la viscosidad aumenta con el tiempo, a temperatura constante. La temperatura de gelificacin vara entre 30 y 40C (para soluciones al 1,5% en peso), dependiendo del tipo de materia prima, del proceso de obtencin utilizado y de la concentracin. La gelificacin ocurre a una temperatura bastante menor, que la temperatura de licuefaccin; esta caracterstica lo hace nico entre los polisacridos. Muchos de sus usos dependen por sobre todo de este alto grado de histrisis.

3, Qu son factores de crecimiento, ejemplo? 4. Por qu se prefiere utilizar Agar Agar como solidificante en vez de gelatina?

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INTRODUCCIN
La ITU es una de las enfermedades ms frecuentes, que consiste en la infeccin por algn agente patgeno (bacterias con mayor frecuencia), de cualquiera de los segmentos del aparato urinario: riones, urteres, vejiga o uretra. PIELONEFRITIS: es la infeccin del rin. URETERITIS: es la infeccin de uno o de los dos urteres. CISTITIS: es la infeccin de la vejiga. URETRITIS: es la infeccin de la uretra. A las Pielonefritis se les conoce tambin como Infecciones del Tracto Urinario Alto. A las Cistitis y Uretritis tambin se les conoce como infecciones del Tracto Urinario Bajo Las Ureteritis son generalmente una extensin de la infeccin en el rin o en vejiga (Cistitis). FACTORES PREDISPONENTES A UNA ITU El sexo femenino, porque la longitud de la uretra femenina es pequea, y se favorece que las infecciones asciendan desde la regin perineal. Los varones que tienen la prstata aumentada de tamao, porque se tiende a retener la orina debido a que la prstata aumentada de tamao genera obstruccin parcial o total en el segmento que corresponde a la uretra. Uso de ropas ajustadas, predispone a desarrollar infecciones urinarias por la presin que ejercen estos que hacen que la orina refluya hacia el interior de las vas urinarias favoreciendo la contaminacin de estas. La retencin voluntaria de la orina, es importante que una persona use el uirinario, tan pronto siente ganas de hacerlo Las personas que ingieren poca ingesta de lquidos. Las personas diabticas, por la facilidad que tienen para todo tipo de infeccin. Aquellos que tienen alguna malformacin congnita de las vas urinarias.

SNTOMAS DE LAS ITU Lo fundamental es el ardor al orinar conocido como disuria, otros sntomas agregados pueden polaquiuria (orinar varias veces en cantidad menor a lo habitual), dolor al final de la emisin, fiebre, nuseas, vmitos, malestar general, dolor lumbar dependiendo de la localizacin de la infeccin. Cuando es una infeccin urinaria alta se suele acompaar de fiebre, malestar general, dolor lumbar, nuseas o vmitos; mientras que cuando es baja no. Si se trata de una uretritis gonoccica (se hace nicamente evidente en el varn), que es una enfermedad de transmisin sexual, se presenta ardor al orinar y al inicio de la miccin se evidencia una secrecin blanquecina maloliente con el color parecido al de la "leche condensada". UROCULTIVO EL urocultivo se utiliza para diagnosticar bacteriuria, la orina constituye un mtodo excelente para cultivar la mayor parte de microorganismos que infectan el aparato urinario.

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La combinacin de piuria con bacteriuria considerable sugiere la presencia de una infeccin urinaria. Utilidad Clnica Cuando los sntomas indican una posible infeccin urinaria como: dolor y sensacin de calor al orinar, as como urgencia frecuente de orinar. Cuando un paciente esta canalizado por largo tiempo, aunque no muestre sntomas de infeccin. En mujeres embarazadas para monitorear cualquier bacteria en la orina que pueda causar algn problema al beb.

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PRCTICA N 06 AISLAMIENTO DE PATGENOS EN INFECCIN URINARIA

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