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    Clonación Acelular PCR

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    Karen Paco Mendívil
    La PCR o reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de amplificación de ADN que permite obtener múltiples copias de una secuencia de ADN objetivo. Consiste en ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación de cebadores y elongación, lo que permite duplicar exponencialmente la secuencia diana. La PCR se utiliza ampliamente en aplicaciones médicas y de biotecnología como detección de enfermedades, tipificación de muestras forenses y estudios evolutivos.

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    Clonación Acelular PCR

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    Karen Paco Mendívil
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    La PCR o reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de amplificación de ADN que permite obtener múltiples copias de una secuencia de ADN objetivo. Consiste en ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación de cebadores y elongación, lo que permite duplicar exponencialmente la secuencia diana. La PCR se utiliza ampliamente en aplicaciones médicas y de biotecnología como detección de enfermedades, tipificación de muestras forenses y estudios evolutivos.

    Título original

    Clonación acelular PCR

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    La PCR o reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de amplificación de ADN que permite obtener múltiples copias de una secuencia de ADN objetivo. Consiste en ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación de cebadores y elongación, lo que permite duplicar exponencialmente la secuencia diana. La PCR se utiliza ampliamente en aplicaciones médicas y de biotecnología como detección de enfermedades, tipificación de muestras forenses y estudios evolutivos.

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    Clonación Acelular PCR

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    La PCR o reacción en cadena de la polimerasa es una técnica de amplificación de ADN que permite obtener múltiples copias de una secuencia de ADN objetivo. Consiste en ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación de cebadores y elongación, lo que permite duplicar exponencialmente la secuencia diana. La PCR se utiliza ampliamente en aplicaciones médicas y de biotecnología como detección de enfermedades, tipificación de muestras forenses y estudios evolutivos.

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    CLONACIN ACELULAR: REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA, PCR

    BIOTECNOLOGA MDICA Ing. Cinthia Crdova Barrios

    Introduccin general a la clonacin

    Conjunto de elementos genticamente idnticos entre s y a su precursor. Clonacin es una amplificacin gentica

    Clonacin
    CLONACIN DE MOLCULAS
    CELULAR: Con clulas, es la amplificacin de un inserto, asistida por vectores en clulas anfitrionas en cultivo. Tecnologa del DNA recombinante ACELULAR: Clonacin de molculas sin la intervencin de clula alguna, amplificacin in vitro de molculas de DNA y RNA mediante la reaccin en cadena de la polimerasa.

    PCR

    Amplificacin directa de un gen o un fragmento de DNA o cDNA, presentes en mezclas de muy diversas fuentes.

    Amplificacin

    Deteccin

    Aplicaciones

    Clonacin acelular de fragmentos de DNA. Deteccin de secuencias. Secuenciacin de cidos nucleicos. Establecimiento de polimorfismos de secuencia. Rastreo de mutaciones. Tipificacin de DNA para trasplante. Diagnstico de enfermedades genticas. Resolucin de problemas forenses. Resolucin de problemas arqueolgicos. Estudios evolutivos. Deteccin de clulas tumorales. Deteccin de microorganismos infecciosos.

    PCR: Requerimientos
    Termociclador

    Cebadores o primers

    DNA polimerasa

    dNTPs y Mg

    Sustratos para la sntesis de las innumerables copias de DNA y el cofactor (Mg de 1-4 mM)

    Oligonucletidos sintticos de cadena sencilla de 18 a 30 nt. Sus secuencias son complementarias a los dos extremos 3 de la regin diana. La posicin donde hibridan los cebadores define la longitud del fragmento.

    Termoestable y activa a temperaturas relativamente altas (95C). Polimerasa taq (Thermus aquaticus)

    PCR: Etapas del proceso


    Templado o hibridacin
    Calentamiento para la separacin de las dos hebras del DNA. Tiempo: Incubacin (30-120 s). Temperatura: 68-97 C Enfriamiento rpidos por debajo de Tm. Hibridacin de las hebras sencillas del DNA con los cebadores. Tiempo:10-120 s. Temperatura: 37-65 C Amplificacin, DNA pol elonga los cebadores, empleando como molde ambas hebras originales Tiempo: Incubacin (1-3 min). Temperatura: 72-75 C

    Desnaturalizacin

    S e aade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos. Previa antes de la desnaturalizacin para inactivar proteasas y nucleasas ltima, prolongacin de la ltima elongacin, que permita que se completen todos los fragmentos.

    Elongacin

    PCR: Etapas del proceso

    PCR: Etapas del proceso

    PCR: ETAPAS DEL PROCESO

    PCR: ETAPAS DEL PROCESO

    PCR: Amplificacin global


    N de ciclos realizados N total de copias N de copias largas N de copias dianas Dianas/total

    1
    2

    2
    4

    2
    4

    0
    0

    0
    0

    3
    4 5 10 20

    8
    16 32 1024 ~ 106

    6
    8 10 20 40

    2
    8 22 1004 ~ 106

    25%
    50% 69% 98% 99.996%

    40
    X

    ~ 1012
    2X

    80
    2X

    ~ 1012
    2X- 2X

    100%

    Caractersticas del proceso


    Los productos de cada ciclo sirven de molde para el siguiente, la acumulacin de copias es exponencial. De cada etapa, debe optimizarse dependiendo de la secuencia concreta que se quiera amplificar Elevada, determinada por la secuencia de los cebadores y las condiciones del templado.
    Rendimiento
    Capacidad de deteccin

    Alta, puede detectar una nica molcula de DNA

    Capacidad de copiar secuencias con precisin, sin introducir mutaciones

    N= nmero de copias. N0= nmero de molculas iniciales. R= rendimiento de cada ciclo (0.7 o 0.8) X= nmero de ciclos

    Especificidad

    Duracin

    Fidelidad

    Automatizacin de la PCR

    Se utiliza termocicladores, para programar los cambios de temperatura segn el carcter cclico del proceso. Permite la realizacin de un nmero elevado de ciclos. Se aumenta la precisin del proceso.

    Variantes del mtodo:


    PCR larga o L-PCR
    Supera los lmites de la PCR convencional Amplifica con fidelidad regiones diana de gran tamao Se aade otra enzima.

    PCR anidada

    Realizar una segunda reaccin de PCR con dos cebadores nuevos que hibridan dentro del fragmento diana amplificado por el primer par

    PCR inversa

    Clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en posicin vecinal a secuencias diana conocidas. Amplificar la regin externa que flanquea a los cebadores.

    Variantes del mtodo: pcr anidada

    Variantes del mtodo: PCR inversa

    Variantes del mtodo: PCR inversa

    Variantes del mtodo:


    PCR con adaptadores.
    Puede amplificarse una regin de DNA de secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de restriccin unos adaptadores.

    PCR asimtrica

    Se generan copias de hebra sencilla de un DNA. Se aaden cantidades muy diferentes de ambos cebadores.

    RT-PCR

    Amplificacin de RNA a travs de la sntesis previa de su cDNA, que despus se amplifica por PCR.

    Variantes del mtodo: PCR con adaptadores

    Variantes del mtodo: RT-PCR

    Variantes del mtodo: RT-PCR

    Variantes del mtodo: PCR real time o qPCR

    Amplificar y simultneamente cuantificar de forma absoluta el producto.

    Requiere de molde de ADN, cebadores, dNTPs, polimerasa termoestable y fluorforo

    Se requiere de un termociclador termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado.

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