FASE 0.

PREPARACIN
Objetivo: puesta en cultivo de explantos Punto de partida: la toma de un fragmento vegetal hace que ste no reciba sustancias ni estmulos del resto del cuerpo de la planta, por lo que se produce un desequilibrio. Para tener xito en el cultivo se debe restablecer dicho equilibrio. Acciones a realizar: adquirir conocimientos sobre la especie y variedad a cultivar (genotipo, etc.), as como de los procedimientos de cultivo in vitro, y especficamente de micropropagacin. La informacin previa a adquirir es respecto a:

Seleccin y localizacin del individuo concreto a micropropagar Estado fisiolgico de la planta madre Conocimiento y optimizacin del estado sanitario de la planta madre Tratamientos especficos previos a realizar, en su caso (ruptura de dormicin, termoterapia, prelavados, tratamientos fitosanitarios, aislamiento, etc) Composicin del medio de cultivo y reguladores Seleccin de las condiciones de cultivo (recipientes, iluminacin, temperatura, etc.)

7.2 FASE 1. INICIACIN

Objetivo: observar la iniciacin del desarrollo de los explantos en las condiciones adecuadas, y en el sentido previsto. Acciones a realizar: siguiendo lo determinado en la fase de preparacin, se proceder a la:

Separacin de un fragmento de la planta madre Esterilizacin del material vegetal Obtencin del explanto a cultivar Incubacin del explanto en las condiciones preestablecidas Espera: tiempo de respuesta Observacin del xito de la iniciacin: el explanto se desarrolla libre de contaminaciones y en el sentido previamente seleccionado.

Principales problemticas:

Contaminaciones Falta de desarrollo del explanto Desarrollo diferente al esperado o Pardeamiento

7.3 FASE 2. MULTIPLICACIN

Objetivo: Produccin de multitud de explantos idnticos genticamente, con desarrollo homogneo, capaces de transformarse en plntulas completas. Acciones a realizar: dejar desarrollarse los explantos durante un tiempo (ej. 3-6 semanas) y subcultivarlos peridicamente para multiplicar su nmero. Elegir para ello una va de multiplicacin. Vas de multiplicacin: se dispone de varias opciones derivadas de la combinacin de tres pares de alternativas, si bien en la realidad no pueden producirse todas las combinaciones. En varios casos es posible multiplicar la planta mediante ms de una opcin, seleccionndose la que mejores resultados ofrezca. Las vas de multiplicacin son:

Organognesis vs. Embriognesis

Yemas preexistentes vs. Estructuras adventicias Directa vs. Indirecta

Gautheret

7.3.1 Multiplicacin mediante organognesis adventicia indirecta Es lo que se denomina cultivo de callo. El desarrollo de callo es un crecimiento de tipo tumoral que se produce por un desequilibrio hormonal en las clulas del explanto. El callo est formado por clulas vegetales que se dividen rpidamente de forma asncrona y en el que no existe una programacin de la diferenciacin, de forma que no pueden producirse rganos ni tejidos con funciones determinadas y no da lugar a plntulas definidas.

Callo de violeta africana a) Tipos de explantos que originan callo. Cualquiera, siempre que reciba el estmulo apropiado. Los explantos preferentes son los que cumplen las siguientes caractersticas:

Sin programa de diferenciacin predefinido Escasa diferenciacin Alta tasa de divisin celular

Son explantos habituales para el desarrollo de callo los fragmentos de hojas o de tallo que contengan tejidos vasculares, siempre sin yemas axilares. b) Tipos de callo: potencial morfognico y regeneracin Aunque el callo sea un crecimiento desorganizado y de tipo tumoral, no todos los callos son equivalentes. Algunos tienen un alto potencial morfognico y de regeneracin, es decir, recibiendo los estmulos adecuados en un determinado momento pueden iniciar una organizacin celular y producir estructuras adventicias, yemas vegetativas o embriones somticos, que se desarrollarn posteriormente como tallos o como embriones enteros. Este tipo de callo morfognico es el que se busca; una vez se tenga el suficiente nmero de estos callos morfognicos se transferirn a otro medio de cultivo que incluya los reguladores de crecimiento adecuados para promover dicha organizacin celular e iniciar la obtencin de las correspondientes plntulas (o en su caso de los embriones). La morfognesis de los callos pueden dirigirse en diferentes sentidos; de ellos no es deseable la formacin de races, y se busca la de tallos adventicios o embriones.

Callo de violeta africana

Callo de zanahoria c) Eficiencia del cultivo de callo como sistema de multiplicacin in vitro. Depende de:

Intervalo entre iniciacin y regeneracin Nmero de subcultivos posibles (hacer aqu un clic al siguiente apartado) Formacin de estructuras adventicias: tasa y frecuencia Capacidad de regeneracin de tallos (o embriones) Capacidad posterior de desarrollo de races para la produccin de plntulas completas

Nmero de subcultivos posibles Tericamente un callo se puede subcultivar indefinidamente, sin embargo en la prctica el nmero recomendable de subcultivos es limitado. El callo se obtiene gracias a que se provoca un desequilibrio celular mediante el aporte de reguladores de crecimiento, este desequilibrio se va incrementando con el tiempo de cultivo en presencia de dichos reguladores, que se acumulan en las clulas y pueden favorecer la aparicin de mutaciones. Si la concentracin de reguladores es excesivamente elevada, o si se mantiene durante un tiempo excesivo el porcentaje de explantos mutados ser alto; en un determinado nmero de ellos las mutaciones sern deletreas y no se podrn producir plntulas completas, reduciendo por tanto la eficiencia del sistema, otro porcentaje producir plntulas completas pero que lleven mutaciones no deletreas e indeseables en un sistema de micropropagacin. d) Ventajas y desventajas de la multiplicacin va callo.

Es la ms rpida, pero tiene una baja estabilidad gentica para la mayora de las especies, debido a que el desequilibrio para causar el desarrollo del propio callo favorece la aparicin de mutaciones; esta inestabilidad gentica hace que este procedimiento slo se utilice en determinadas ocasiones. e) Metodologa El sistema para inducir la formacin de yemas adventicias incluye la adicin de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo, preponderando las auxinas sobre las citoquininas; en concreto para inducir el desarrollo de callo suele utilizarse el 2,4-D combinado con benciladenina o con quinetina, si bien depende de la especie a cultivar. 7.3.2 Multiplicacin mediante organognesis adventicia directa La organognesis adventicia directa consiste en inducir la diferenciacin de yemas de tallo directamente sobre un tejido que no las tenga preformadas y sin que ste pase por un estado previo de formacin de callo. Como en el cultivo de callo este sistema evita la utilizacin de yemas preformadas, pero consigue que se formen nuevos primordios foliares donde no los haba, induciendo un nuevo patrn de diferenciacin.

a) Tipos de explatos Si bien tericamente es posible la organognesis adventicia directa a partir de cualquier grupo de clulas, con algunos exlantos se puede llevar a cabo mas fcilmente, estos son:

Explantos de hoja. Son los mas frecuentes. Por ejemplo: Begonia, Crasulceas, Pelargonium, Peperomia, Saintpaulia (un buen nmero de plantas ornamentales). Explantos de zonas internodales del tallo. Explantos de bulbo. En las plantas que producen este tipo de estructuras se usan preferentemente fragmentos de hojas del bulbo, por ejemplo: Hyacinthus, Narcissus, Allium, etc. Explantos de raz: mora, frambuesa, algunos manzanos.

b) Eficiencia del cultivo La tasa de propagacin que puede obtenerse subcultivando este tipo de explantos en medios que continuamente induzcan la formacin de yemas adventicias, aunque ms lenta que en el caso de cultivo de callo, es tambin muy elevada. Como prueba de ello se ha calculado que la capacidad de

multiplicacin de Begonia, tomando un fragmento cuadrado de hoja joven de 7cm de lado, es de una produccin 1014 plantas al final de un ao de subcultivos. c) Ventajas y desventajas de la multiplicacin por organognesis adventicia directa La multiplicacin mediante formacin de yemas adventicias sin formacin previa de callo no es tan rpida como la va de callo, pero sigue siendo muy rpida, por lo que el descenso de velocidad no es una gran desventaja. Su estabilidad gentica es sensiblemente mayor que la del callo, si bien existen casos en que se ha observado una proporcin excesiva de mutaciones en la descendencia; esto se puede deber a la formacin de microcallos en los explantos, los cuales no se podran observar fcilmente a simple vista debido a la gran profusin del desarrollo del material vegetal. Estos microcallos se forman frecuentemente por un exceso en las dosis de reguladores aplicados. El sistema se puede aplicar en diversos tipos de especies, tal y como se ha indicado en relacin al tipo de explantos utilizados, sin embargo no es posible utilizarlo para la propagacin de plantas que sean quimeras o que presenten un aspecto variegado debido a la presencia de virus en su interior. d) Metodologa El sistema para inducir la formacin de yemas adventicias incluye la adicin de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo, preponderando las citoquininas sobre las auxinas. En este caso es recomendable evitar el uso de 2,4-D como auxina, ya que favorece el desarrollo de callo. Como ejemplo se puede citar la formacin de 100 bulbillos al cultivar los fragmentos de una hoja escamosa del bulbo de Lilium durante 4-6 semanas, lo que constituye una tasa de micropropagacin rpida. En el extremo contrario un sistema lento es el descrito para Narcissus: una hoja escamosa de su bulbo que se fragmenta en diversos explantos y al cultivarla en un medio con 4-12 mg.l-1 de Benciladenina y 1-2 mg.l-1 de NAA slo produce unos 20 bulbillos, si bien si se compara con la velocidad de propagacin tradicional el avance es sustancial, ya que slo producira 2 bulbillos en un tiempo equivalente. Algunas de las especies a las que se ha aplicado con xito la multiplicacin va formacin de yemas adventicias son: Gesneracias (Achimenes, Sinningia, Saintpaulia, Streptocarpus), Begonias, Gerberas, Cactaceas, y algunas monocotiledneas que forman bulbos (Hyacinthus, Narcissus, Allium, Lilium). 7.3.3 Multiplicacin mediante yemas preexistentes a) Tipos de explanto La multiplicacin por yemas preexistentes consiste en promover el mximo desarrollo de las yemas que contiene un explanto, por lo tanto debe realizarse mediante una organognesis directa. Por la misma razn el tipo de explanto a utilizar estar limitado a cualquiera que contenga yemas preexistente: una yema apical de tallo o una seccin nodal de tallo con uno o ms nudos; tambin se considera la posibilidad de que el explanto sea un pice de raz, aunque este tipo de cultivos es muy infrecuente como sistema de micropropagacin. Este sistema es el ms semejante al de la propagacin convencional, ya que simplemente utiliza las yemas que ya existen, hace que se desarrollen como tallos y que posteriormente enracen, dando as lugar a plantas completas. Las diferencias respecto a la propagacin in vivo son simplemente el reducido tamao del explanto, que a partir de un individuo permite obtener un nmero de explantos mucho ms alto que de esquejes, el causar el desarrollo de un gran nmero de yemas, que en condiciones naturales estaran inactivas, y el facilitar el enraizamiento posterior de todas las plntulas, lo que para muchas especies en condiciones naturales es frecuentemente problemtico. b) Eficiencia del cultivo y metodologa El sistema para inducir la formacin de yemas adventicias parte de un explanto con una o varias yemas, que mediante los reguladores adicionados al medio de cultivo (principalmente citoquininas, y una concentracin mucho menor de auxinas si fueran requeridas) se desarrolla formando una rama, que a

su vez se ramifica; cada una de las ramas nuevas tambin sufre un mximo de ramificacin. En el momento de realizar un subcultivo se fragmenta el explanto en mltiples nuevos explantos, cada uno de los cuales tendr una o varias yemas que volvern a ramificarse, y as en cada subcultivo. Al finalizar la fase de multiplicacin se deber aislar cada una de las plntulas y cambiarlas a un medio de cultivo en el que ya no se promueva la ramificacin sino que se pase a la siguiente fase.

Los explantos suelen subcultivarse como media cada 4-6 semanas, y el nmero de subcultivos debe limitarse para evitar la aparicin de mutaciones por acmulo de citoquininas o por formacin de microcallos que pasen inadvertidos. Una recomendacin frecuente es restringir estos subcultivos a 4-5, si bien en funcin de la especie a micropropagar su nmero es muy variable.

Cultivos de secciones nodales de pepino (izquierda) y de vid (derecha) La tasa de multiplicacin mediante este procedimiento es logartmica. El nmero de plntulas al final de la fase de multiplicacin depender del nmero de explantos iniciales (a), del tiempo durante el que se prolongue esta fase de multiplicacin y del nmero de subcultivos que se realicen (n), as como del nmero de nuevos explantos obtenidos en cada subcultivo (b). Suponiendo que no haya ningn tipo de prdidas el nmero de plntulas finales obtenidas ser a.bn. Si pusiramos en cultivo slo 10 explantos y se subcultivaran mensualmente durante 5 meses, de forma que cada uno de ellos diera lugar a 8 nuevos explantos, al final de esos 5 meses se tendran ms de 32000 plantas, y si se realizara un subcultivo ms el nmero final de plantas superara las 250000. En la prctica son conocidas algunas especies por su mayor o menor velocidad de multiplicacin in vitro mediante este sistema:

Multiplicacin rpida. La fresa: 10 explantos cada 2 semanas. Se obtienen fcilmente 10 millones de plantas en 3-4 meses. Multiplicacin lenta. El arndano: 3 nuevos explantos cada 6 semanas. Se obtienen unas 20000 plantas al ao. Multiplicacin media. 5 explantos cada 4 semanas. Se obtienen unos 2 millones de plantas en 9 meses.

La forma de controlar al mximo la dominancia apical y promover la ramificacin es mediante la aplicacin de citoquininas, y si es necesario siempre aportando una determinada concentracin menor de auxinas. En la prctica la principal diferencia entre la induccin de yemas adventicias y

el incremento de la ramificacin exilar es la dosis de citoquininas aportadas, que en este segundo caso es mas baja (por ejemplo una cantidad promedio es de 2 mg/l de Benciladenina) La mayor limitacin intrnseca a este sistema es el exceso de dominancia apical que puedan tener en algunos casos o especies los explantos. Cuando se produce esta dominancia apical cada vez que se produce una nueva rama su meristemo apical inhibe el desarrollo de las yemas inferiores, impidiendo as la ramificacin a pesar del aporte de las citoquininas del medio de cultivo. En estos casos debe acudirse a procedimientos que eliminen la nueva dominancia apical cada vez que se produzca, tales como tcnicas de despunte, in vitro layering (peral, Acer, Btula), o incluso corte individualizado de cada una de las secciones nodales en cada ciclo de multiplicacin. c) Ventajas y desventajas de la multiplicacin mediante yemas preexistente La principal desventaja de este sistema respecto a los anteriores es su menor velocidad de multiplicacin, lo que sin embargo no evita poder obtener un nmero muy elevado de plntulas, y suficientes en la mayora de las ocasiones, en periodos de entre 6 y 12 meses de cultivo. La gran ventaja es su elevada estabilidad gentica, ya que el sistema no altera el tipo de desarrollo del vegetal sino tan slo promueve la ramificacin; no obstante en algunos casos pueden desarrollarse algunos microcallos, que tambin pueden pasar inadvertidos y causar que al final de la micropropagacin haya plantas con mutaciones. Otras limitaciones que se han presentado en algunas ocasiones son la detencin del desarrollo de los explantos y la reduccin de la longitud internodal de los tallos, lo que requerira un aporte de giberelinas para facilitar los subcultivos y la obtencin final de plntulas; el aporte de giberelinas dificulta el enraizamiento posterior de los explantos, por lo que debe hacerse con sumo cuidado. Este sistema es el ms ampliamente utilizado a nivel comercial, y puede ser aplicado sin problemas a las plantas, sean o no quimeras. 7.3.4 Multiplicacin mediante embriognesis La multiplicacin mediante embriognesis puede ser indirecta o directa en funcin de que en el explanto se produzca o no un desarrollo de callo previo, si bien en la prctica la embriognesis directa es mucho mas infrecuente. Por otra parte la multiplicacin mediante embriognesis siempre ser mediante estructuras adventicias, ya que no existen embriones preformados ms all de los embriones cigticos. Antes de introducirse en la multiplicacin mediante embriognesis conviene recordar algunos conceptos bsicos a) Tipos de explantos Los embriones no cigticos se originan a partir de clulas del esporofito de la planta; la embriognesis puede producirse a partir de: Una nica clula. Se divide asimtricamente de la misma forma que lo hace un cigoto para dar un embrin, por lo que es una embriognesis directa Una agrupacin de varias clulas se divide inicialmente de forma desorganizada, para a continuacin organizarse algunas de ellas en una estructura que es el inicio del desarrollo del embrin somtico. b) Fases de la embriognesis Cualquiera que sea el inicio de la embriognesis, se siguen las fases habituales de la misma. Las fases por la que pasa un grupo de clulas somticas que sufren un proceso de embriognesis somtica indirecta son: 1. Induccin y proliferacin de callo embriognico. En esta fase el objetivo es la produccin de un callo con abundantes masas meristemticas de las que luego podrn

emerger los embriones. Para ello el medio de cultivo debe contener, adems de nitratos, amonio como fuente de nitrgeno y tambin niveles elevados de potasio. En cuanto a reguladores se precisa el aporte de auxinas y citoquininas, preponderando las primeras sobre las segundas.

2. Formacin y crecimiento de los embriones. En esta fase es importante reducir hasta casi eliminar el aporte de auxinas, mientras que el de citoquininas se elevar en mucha mayor proporcin; tambin es importante evitar el acumulo de etileno en el interior del recipiente de cultivo, que impide la organizacin celular necesaria para formar los embriones. Una vez se inicia el desarrollo de los embriones es conveniente aislarlos del callo embriognico para que puedan formar una estructura independiente. En esta etapa el embrin pasa una serie de fases, tpicamente conocidas como fase globular, fase acorazonada y fase torpedo.

3. Maduracin de los embriones ya desarrollados. Tras pasar por la fase torpedo el embrin empieza a madurar, es decir, pierde agua para dar lugar a una estructura vegetal con una proporcin de agua mucho menor que la de una planta en desarrollo, que es el embrin maduro, y que se puede conservar con relativa facilidad en ese estado durante un tiempo prolongado. Para favorecer la maduracin de los embriones se ha propuesto la aplicacin de cido abscsico en el medio de cultivo, que se basa en el aumento natural en los niveles de dicho regulador al final del proceso de maduracin de las semillas en la planta madre y en su relacin con la resistencia de la semilla a la desecacin. Alternativamente, los embriones ya desarrollados se pueden someter a un lecho de aire estril seco que los vaya desecando poco a poco; esto puede hacerse dejndolos durante 12-24h sobre placas Petri abiertas en el interior de la cabina de flujo laminar en funcionamiento. 4. Germinacin. Los embriones desecados pueden volver a hidratarse y germinar si se colocan en las condiciones adecuadas de humedad y temperatura, siempre que no se encuentren en dormicin. Los embriones tambin se pueden encapsular de forma que constituyan una semilla artificial que pueda conservarse o sembrarse de forma equivalente a como se hace con las semillas tpicas de la especie. En esta encapsulacin se pueden aadir compuestos que faciliten la germinacin, incluyendo aspectos como la utilizacin de fungicidas en su pildoracin. Los reguladores que se utilizan para producir una embriognesis indirecta coinciden en general con los utilizados para producir una organognesis indirecta; las diferencias principales se basan en las cantidades y proporciones relativas de auxinas y citoquininas utilizadas. Adems, estos requerimientos

difieren segn la especie a cultivar, si bien existen unas tendencias comunes segn la planta sea monocotilednea o dicotilednea. Las pautas generales para organognesis o embriognesis indirecta de dicotiledneas son las comparadas en la tabla. c) Patrn de desarrollo del embrin somtico, eficiencia del sistema y subcultivos Es importante reconocer al embrin al inicio de su desarrollo sobre las masas meristemticas del callo embrionario, de forma que podamos aislarlo, ya que en caso contrario su desarrollo podra quedar comprometido por la alta tasa de divisin celular del resto de las clulas meristemticas de este callo. Para ello es importante su reconocimiento mediante:

Caracteres morfolgicos. Cutinizacin de la superficie de las clulas que inician el desarrollo embrionario. Incremento de nutrientes que se acumulan como sustancias de reserva o estructuras celulares, dando a las clulas un aspecto denso y opaco.

Posteriormente se podr realizar un seguimiento visual del desarrollo embrionario, segn las tres fases mencionadas anteriormente y caractersticas de las especies dicotiledneas; en las monocotiledneas el proceso es paralelo pero algo diferente. Otro aspecto a considerar es que si bien el embrin somtico pasa por los mismos estados de desarrollo que el embrin cigtico, su diferente origen permite algunas variaciones. Entre ellas, e incluso si el embrin se inicia a partir de una nica clula, a lo largo de su desarrollo las clulas que se producen pueden dividirse segn diferentes opciones y dar lugar finalmente a un embrin originado de diferentes formas. En cuanto al nmero de subcultivos que pueden realizarse durante la fase de multiplicacin por embriognesis indirecta, stos corresponden exclusivamente a la primera fase, es decir a la proliferacin de callo embriognico. Este callo, a semejanza con el callo organognico, puede ser fragmentado y subcultivado de forma que se incremente el nmero de callos embriognicos, con lo que al final de la fase de multiplicacin se puede tener un nmero indefinido de stos. Posteriormente en cada callo embriognico se inducira la formacin de varios embriones al cambiar de medio de cultivo. Sin embargo el nmero de subcultivos posibles en la prctica no es ilimitado, ya que por encima de un determinado nmero se ha observado que los callos van perdiendo capacidad embriognica. Este nmero depende de la concentracin de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo y de la especie cultivada, y se han formulado tres hiptesis explicativas, la hiptesis fisiolgica, la hiptesis gentica y la hiptesis competitiva que combina las dos anteriores.

Esquematizacin de la hiptesis competitiva.

d) Anomalas del desarrollo embrionario El desarrollo embrionario no est exento de sufrir anomalas que impidan o dificulten su germinacin o la obtencin de nuevas plntulas completas. Estas anomalas tambin se producen de hecho en los embriones cigticos formados mediante reproduccin sexual convencional, y seran responsables de diversos problemas bien identificados que limitan la germinacin de las semillas y su posterior viabilidad. Un proceso de embriognesis somtica es por ejemplo el detallado para zanahoria; las principales anomalas identificadas son la formacin de embriones con ms de un pice o sin el pice bien definido, embriones con ms de un extremo radicular, embriones con ms de dos cotiledones, embriones fusionados que comparten algn grupo de clulas, o embriones que inician su formacin sobre otro embrin previamente formado y en estado de crecimiento. Esta ltima anomala de la embriognesis somtica es relativamente frecuente y difcil de detener, y se conoce como embriognesis recurrente; al producirse de forma continuada una y otra vez es un problema grave para la obtencin final de embriones maduros. e) Ventajas y desventajas de la embriognesis somtica. Aplicaciones. El sistema se puede utilizar para todo tipo de plantas excepto las que sean quimeras o presenten un patrn de desarrollo que simule una quimera. Es un procedimiento muy valorado en los programas de mejora, ya que los callos son un tipo de tejido muy favorable para inducir mutaciones o seleccionar plantas con caracteres concretos, y a partir de ellos la produccin de numerosos individuos mediante embriognesis es muy rpida y bastante estable. Al implicar la obtencin inicial de callo en la gran mayora de las ocasiones existe una cierta prevencin a utilizar este mtodo, sin embargo la aparicin de plantas con mutaciones es mucho menos frecuente utilizando embriognesis somtica indirecta que mediante organognesis indirecta. La razn se atribuye a los mayores requerimientos de integridad y de organizacin celular que deben mantener las clulas para dar lugar a un embrin, frente a los requeridos para iniciar una yema adventicia; gracias a ello es posible en muchas ocasiones micropropagar una planta mediante embriognesis somtica aunque sea una va indirecta. Los embriones producidos sern clnicos.

Este procedimiento, adems de cmo una de las opciones de micropropagacin, se ha utilizado como un mtodo de saneamiento de plantas portadoras de virus, como es el caso tpico de los ctricos. Mediante la formacin de embriones somticos en explantos formados por la nucela de dichos ctricos pueden regenerarse plantas sanas. IR A SANEAMIENTO Finalmente, podemos observar algunas de las fases de la produccin de embriones somticos y su posterior germinacin, as como un esquema con un caso prctico de embriognesis somtica a partir de un cultivo de callo embriognico y, alternativamente, a partir de un cultivo de clulas en suspensin.