Universidad Nacional Autnoma

de Mxico
Departamento de ciencias
biolgicas
Seccin de bioqumica y
farmacologa humana
Biologa General.
Grupo 1101
Microscopa, investigacin
previa
Daniel Raygoza Trejo

Realizado el 13/09/15. Entregado el 14/09/15

Para qu usar un microscopio?

Es usado para observar los seres microscpicos, sus objetivos van
principalmente centrados en la medicina y en la industria.
Breve historia del microscopio
El microscopio fue inventado en el ao 1610 por Zacharias Janssen aunque
tambin hay quien afirma que fue Galileo Galilei el verdadero autor.
Este primer instrumento era un microscopio ptico en el que gracias a la
refraccin poda obtener un gran aumento gracias a dos lentes.
A mediados del siglo XVI, Anton van Leeuwenhoek ser quien describa
protozoos, glbulos rojos, bacterias y espermatozoides gracias a microscopios
que l mismo construa tallando pequeas esferas de cristal que no superaban
el milmetro de dimetro.
Gracias a este invento Robert Hooke logr observar en el ao 1665 un pequeo
trozo de corcho y observ que este era poroso y que cada cavidad formaba una
especie de pequeas celdas. Esta fue la primera vez que se observaron clulas
muertas. Tiempo ms tarde Marcello Malpighi ser quien estudie por primera
vez tejidos vivos en microscopio.
Ya en el siglo XIX, comienzan a fabricarse microscopios acromticos que
mejorarn notablemente las imgenes obtenidas.
En el ao 1931, Max Knoll y Ernst Ruska desarrollaron el primer microscopio
electrnico de transmisin con el que se consigue aumentos de 100.000X.
Recin en el ao 1942 se crea el microscopio electrnico de barrido.
Clasificacin de los microscopios

Microscopio compuesto

Microscopio ptico

Microscopio estreo o de direccin

Microscopios digitales

Microscopios fluorescentes

Microscopios electrnicos

Microscopios computalizados

Microscopio ptico compuesto

Parte mecnica:
La parte mecnica del microscopio comprende el pie o la base, el tubo, el
revlver, el asa, la platina, el carro y el tornillo micromtrico. Estos elementos
sostienen la parte ptica y de iluminacin; adems, permiten los
desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.

El pie y soporte: contiene la base sobre la que se apoya el microscopio

y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular.

La columna o brazo: llamada tambin asa, es una pieza en forma de C,

unida a la base por su parte inferior mediante una bisagra, permitiendo
la inclinacin del tubo para mejorar la captacin de luz cuando se
utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porcin superior y por el
extremo inferior se adapta al pie.

El caon

tiene forma cilndrica . El caon se encuentra en la parte superior de

la columna, enfoca el objeto mediante un sistema de cremalleras, las
cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos.

El tornillo macromtrico o macroscpico: girando este tornillo,

asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizndose en sentido
vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos
largos permiten el enfoque rpido de la preparacin.

El tornillo micromtrico o microscpico: mediante el ajuste fino con

movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la
platina, se logra el enfoque exacto y ntido de la preparacin. Lleva
acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm, que se utiliza
para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos.

La platina: es una pieza metlica plana en la que se coloca el objeto

que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje ptico del tubo, que
permite el paso de los rayos luminosos a la preparacin. La platina
puede ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos puede
ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o
producir movimientos circulares.

Las pinzas: son dos piezas metlicas que sirven para sujetar el objeto.
Se encuentran en la platina.

El revlver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se

enroscan los objetivos. Al girar el revlver, los objetivos pasan por el eje
del tubo y se colocan en posicin de trabajo, lo que se nota por el ruido
de un pin que lo fija.

Parte ptica:

El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la

cercana de la pieza con el ojo del observador. Tiene como funcin aumentar la imagen
formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van
desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que
poseen una escala micromtrica; estos ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del
objeto observado.

Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revlver y producen el

aumento de las imgenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la
preparacin que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos:
objetivos secos y objetivos de inmersin.

Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna

entre ellos y la preparacin. En la cara externa llevan una serie de ndices que indican
el aumento que producen, la abertura numrica y otros datos. As, por ejemplo, si un
objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es
planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, calculada para una
longitud de tubo de 160 mm. El nmero de objetivos vara con el tipo de microscopio y
el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente
utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.

El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de

lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de
aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre
en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se
distingue por uno o dos crculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

Parte de ilumincacin:
Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la
preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada.
Comprende los siguientes elementos:

Fuente de iluminacin: se trata clsicamente de una lmpara incandescente de

tungsteno sobrevoltada; en versiones ms modernas con leds. Por delante de ella se sita
un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que

permite controlar el dimetro de la parte de la preparacin que queda iluminada, para

evitar que exceda el campo de observacin produciendo luces parsitas.

El espejo: necesario si la fuente de iluminacin no est construida dentro del

microscopio y ya alineada con el sistema ptico, como suele ocurrir en los microscopios
modernos. Suele tener dos caras: una cncava y otra plana. Goza de movimientos en
todas las direcciones. La cara cncava se emplea de preferencia con iluminacin artificial,
y la plana, para natural (luz solar). Los modelos ms modernos no poseen espejos sino
una lmpara que cumple la misma funcin que el espejo.

Condensador: est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los
rayos luminosos sobre el plano de la preparacin, formando un cono de luz con el mismo
ngulo que el del campo del objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su
lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en
contacto con la preparacin cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor
ampliacin); existen condensadores de inmersin, que piden que se llene con aceite el
espacio entre esa lente superior y la preparacin. La abertura numrica mxima del
condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se lograr
aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente
sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajndose para su uso con objetivos
de poca potencia.

Diafragma: el condensador est provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura

para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el
contraste, lo que se hace cerrndolo ms de lo que conviene si se quiere aprovechar la
resolucin del sistema ptico.

Microscopio electrnico de transmisin:

El microscopio electrnico de transmisin (TEM) es un instrumento que
aprovecha los fenmenos fsico-atmicos que se producen cuando un haz de
electrones suficientemente acelerado colisiona con una muestra delgada
convenientemente preparada. Cuando los electrones colisionan con la muestra,
en funcin de su grosor y del tipo de tomos que la forman, parte de ellos son
dispersados selectivamente, es decir, hay una gradacin entre los electrones
que la atraviesan directamente y los que son totalmente desviados. Todos ellos
son conducidos y modulados por unas lentes para formar una imagen final
sobre una CCD que puede tener miles de aumentos con una definicin
inalcanzable para cualquier otro instrumento. La informacin que se obtiene es
una imagen con distintas intensidades de gris que se corresponden al grado de
dispersin de los electrones incidentes.

La imagen del TEM tal como se ha descrito ofrece informacin sobre la

estructura de la muestra, tanto si sta es amorfa o cristalina.
Adems, si la muestra es cristalina, es decir, hay una estructura de planos
peridica, puede ocurrir que varias familias de esos planos cumplan la
condicin de Bragg y difracten de forma coherente la onda electrnica
incidente. Esto da lugar a un diagrama de difraccin, que es una imagen de
distintos puntos ordenados respecto a un punto central (electrones
transmitidos no desviados) que nos aportan informacin sobre la orientacin y
estructura del/los cristales presentes.
Microscopio electrnico de barrido.
El Microscopio electrnico de barrido o SEM (Scanning Electron
Microscopy), utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz
para formar una imagen ampliada de la superficie de un objeto. Es un
instrumento que permite la observacin y caracterizacin superficial
de slidos inorgnicos y orgnicos. Tiene una gran profundidad de
campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la
muestra.

El microscopio electrnico de barrido est equipado con diversos detectores,

entre los que se pueden mencionar: el detector de electrones secundarios para
obtener imgenes de alta resolucin SEI (Secundary Electron Image), un
detector de electrones retrodispersados que permite la obtencin de imgenes
de composicin y topografa de la superficie BEI (Backscattered Electron
Image), y un detector de energa dispersiva EDS ( Energy Dispersive
Spectrometer) permite colectar los Rayos X generados por la muestra y realizar
diversos anlisis semicuantitativo y de distribucin de elementos en
superficies.

Se pueden realizar estudios de los aspectos morfolgicos de zonas

microscpicas de los distintos materiales con los que trabajan los
investigadores cientficos y las empresas privadas, adems del procesamiento
y anlisis de las imgenes obtenidas. Las principales utilidades del SEM son la
alta resolucin (~1 nm), la gran profundidad de campo que le da apariencia
tridimensional a las imgenes y la sencilla preparacin de las muestras.
Cmo se preparan las muestras para los microscopios electrnico de
barrido (SEM) y transmisin (TEM)?
Preparacin de muestras biolgicas para el TEM
En general, la preparacin de estas muestras siempre sigue el mismo protocolo
bsico: fijacin qumica, lavado, deshidratacin en series de concentraciones
crecientes de alcohol o acetona, inclusin en resina y polimerizacin. Segn el
objetivo perseguido, en alguno de estos pasos se incluye una etapa de tincin

con metales pesados, tales como el osmio, el wolframio o el uranio. En todo

caso, este trabajo lo realiza el usuario en su laboratorio.
La siguiente etapa consiste en obtener cortes muy finos del material
polimerizado. Para ello se utiliza un ultramicrotomo que s est disponible en el
Servicio.
Preparacin de muestras de materiales en polvo para el TEM
En la preparacin de este tipo de muestras slo hay que diluir una cantidad
muy pequea de muestra en un disolvente orgnico que no la afecte,
habitualmente dicloroetano o acetona. Tambin se puede utilizar agua si no
hay alternativa. A continuacin se busca la mxima dispersin sumergiendo la
solucin en un bao de ultrasonidos y, al cabo de un tiempo, ya se puede
depositar una gota sobre una rejilla filmada con carbono para ser observada
directamente una vez se haya secado.
En el Servicio se provee al usuario de todo lo necesario en este proceso.
Preparacin de muestras materiales compactas para el TEM
Para este tipo de muestras se sigue un proceso de adelgazamiento en el que es
necesario la utilizacin de varios aparatos. En primer lugar el usuario ha de
aportar una muestra que no supere las 200 m. de grosor. A continuacin, el
primer paso es cortar un disco de 3 mm. de dimetro con el Ultrasonic Disk
Cutter pues este es el tamao de la muestra que se puede introducir en el
TEM. El siguiente paso es excavar el disco por ambas caras hasta obtener una
zona central de unas 20 m. con el Dimpling Grinder. Una vez conseguido, se
introduce este disco en el Ion Milling para que sea atacado por ambos lados
con sendos haces de iones de argn hasta que estos realizan un pequeo
orificio central, alrededor del cual queda una zona suficientemente delgada.

Las muestras destinadas al SEM han de cumplir dos condiciones: deben estar
secas y ser conductoras. El proceso de secado ha de llevarse a cabo
preservando al mximo la estructura original de la muestra. Para ello tenemos
dos alternativas: usar el mtodo clsico de fijacin y deshidratacin qumica
que el usuario realiza en su laboratorio y que finaliza con el secado por punto
crtico en nuestras instalaciones, o utilizar el moderno mtodo de fijacin fsica
por criofijacin que ya est acoplado a uno de los microscopios.
En ambos casos la muestra necesita recubrirse despus con un material que la
haga conductora y permita su observacin en el microscopio.
Recubrimiento de muestras en bajo vaco
Con este mtodo se realizan dos tipos de recubrimientos: spputtering de oro
para obtener las mejores condiciones de imagen y, si se requiere microanlisis
por rayor X, el recubrimiento por hilo de carbono.
Recubrimiento de muestras en alto vaco

Sus aplicaciones van ms all de la necesidad de obtener una muestra

conductora para el SEM. Consigue recubrimientos de grano mucho ms fino y
est preparado para realizar spputtering con distintos metales. Tambin
trabaja por el mtodo de evaporacin, con lo que aumenta el rango de posibles
elementos de recubrimiento. Utiliza electrodos de carbono para evaporarlo y
obtener films que recubren las rejillas destinadas al TEM.
Observacin de muestras criofijadas
El microscopio electrnico de barrido (SEM) puede dotarse de un sistema capaz
de observar la muestra a muy baja temperatura de forma que su preservacin
estructural es mxima y la capacidad de trabajo del microscopio no se afecta
en absoluto, pues ya no tratamos con una muestra hidratada sino congelada.
El proceso se inicia fuera del microscopio, enfriando la muestra a la mxima
velocidad posible mediante nitrgeno nieve. A continuacin ya pasa al sistema
de criobservacin, donde se puede fracturar, sublimar el hielo superficial y
recubrir con oro o carbono para su observacin y/o anlisis. La ventaja de este
sistema es que se puede observar cualquier muestra biolgica o hidratada con
una preparacin mnima y rpida con una buena preservacin estructural.
Para qu le sirven estos microscopios a un alumno de la Lic. en
tecnologa?
La microscopa es indispensable para los alumnos de esta licenciatura ya que
conocer el mundo que es invisible para el ojo humano abre grandes puertas.
Llevar la observacin, que es una parte fundamental del mtodo cientfico, a
otro nivel; debe ser una gran ayuda para comprender mejor el universo donde
nos encontramos y desarrollar tecnologa a partir de esto.